Basic Information

• 英文标题： Immunogenic cell death in cancer: targeting necroptosis to induce antitumour immunity
• 中文标题：免疫原性细胞死亡在癌症中的作用：靶向坏死性凋亡以诱导抗肿瘤免疫力
• 发表日期：07 March 2024
• 文章类型：Review Article
• 所属期刊：Nature Reviews Cancer
• 文章作者：Pascal Meier | John Silke
• 文章链接：https://www.nature.com/articles/s41568-024-00674-x

Abstract

1. 大多数转移性癌症仍无法治愈，这是因为出现了对凋亡具有抗性的克隆细胞，这种情况由肿瘤内异质性和肿瘤进化所推动。
2. 为了改善治疗效果，治疗方法不仅应该杀死癌细胞，还应该激活免疫系统来对抗肿瘤，以清除任何经治疗后仍然存活的残余癌细胞。
3. 尽管当前的癌症疗法严重依赖于凋亡——这是一种主要在免疫学上沉默的细胞死亡形式——但越来越多的兴趣集中在利用如坏死性凋亡这样的免疫原性细胞死亡形式上。
4. 与凋亡不同，坏死性凋亡产生第二信使分子作用于肿瘤微环境中的免疫细胞，向它们发出危险信号。
5. 这种溶解性的细胞死亡形式优化了抗原和佐剂对免疫细胞的供给，通过结合细胞自杀和免疫反应的方法，有可能增强抗癌治疗策略。
6. 在这篇综述中，我们讨论了坏死性凋亡的机制以及它如何激活抗原呈递细胞、促进CD8+ T细胞的交叉启动，并诱导抗肿瘤免疫反应。
7. 我们还探讨了这些策略暴露癌细胞以接受免疫攻击的机会和潜在缺点。

Introduction

1. 细胞拥有感知机制来检测损伤、功能障碍和适应性差异。
2. 在极端情况下，这些途径会触发细胞死亡。
3. 因此，细胞要想变得癌化，就必须抑制或阻止细胞死亡途径的激活。
4. 对肿瘤发生过程的这一认识已经导致了旨在重新建立或增加肿瘤细胞对细胞死亡敏感性的药物的开发。
5. 毫无疑问，无论是传统化疗还是靶向疗法，抗癌药物的治疗指数与其特异性杀死癌细胞的能力密切相关1。
6. 通过激活癌细胞自身的细胞死亡机制来杀死它们的策略得到了临床应用中令人鼓舞的结果的支持，这些结果集中在触发癌细胞死亡的治疗策略上2,3。
7. 然而，即使抗癌疗法导致大量肿瘤细胞死亡，患者通常也会经历复发4。
8. 获得性药物耐受常常阻碍癌症治疗达到稳定和完全的疗效5。
9. 此外，非突变型药物耐受机制也可以支持残留癌细胞的存活，这些细胞随后成为肿瘤复出的储备来源5,6。
10. 为了改善当前的治疗方案并引发持久的保护作用，通过一种能唤醒免疫系统的进程来杀死癌细胞是一种极具前景的策略。
11. 然而，大多数抗癌药物通过凋亡的方式杀死癌细胞7，这是一种形式的细胞死亡，身体每天都会利用它清除超过十亿个细胞，而这种死亡通常不会诱发免疫学反应
12. 与凋亡不同，坏死性凋亡是一种爆炸性的细胞死亡形式，在此过程中，细胞通常会膨胀然后破裂。
13. 这种非凋亡性的细胞死亡是机体清除被病原体感染的细胞的一种自然方式。
14. 以这种方式死亡的细胞还会向周围区域释放大量小分子信号物质，即所谓的损伤相关分子模式（DAMPs），这些物质能够引发炎症并吸引免疫细胞。
15. 鉴于我们对坏死性凋亡作为一种免疫原性的受调控细胞死亡形式的理解不断进步，以及临床中利用抗肿瘤免疫反应的兴趣日益增长，本文概述了凋亡和坏死性凋亡的分子机制、调控、免疫学后果，以及将其作为抗癌疗法的目标所面临的机遇和挑战。

Cell death pathways and immune engagement

1. 细胞死亡是一个正常的稳态过程。
2. 但如果免疫系统被激活，它必须拼凑并调查死亡与危险之间的因果关系。
3. 因此，高级多细胞生物体已经发展出多种相互关联的细胞死亡途径（见框1），以扩展垂死细胞与免疫系统之间沟通的深度。
4. 凋亡是在胚胎发育和成人组织稳态期间细胞周转的默认途径，并且，可能作为结果，它通常是免疫学上静默的。
5. 而在另一端，像坏死性细胞死亡这样的溶解型细胞死亡，与病原体检测相关联，因此会触发强烈的免疫反应。
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Mechanisms of cell death regulation

细胞死亡调控机制

1. 为了便于与坏死性凋亡进行比较，我们首先考察凋亡的分子机制（图1）。
2. 凋亡可以通过外源性和内源性细胞死亡途径触发。
3. 在外源性凋亡中，死亡受体（如肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）、FAS（也称为CD95）、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体1（TRAILR1；也称为DR4）、TRAILR2（也称为DR5）、DR3和DR6）的激活导致caspase 8的激活。
4. 在I型细胞（如免疫细胞）中，caspase 8直接切割并激活执行者caspase 3和caspase 7，导致凋亡并将残留物封装入凋亡小泡，这有助于它们被吞噬细胞清除。
5. 在II型细胞（如非免疫细胞）中，caspase 8的激活效率较低。
6. 因此，死亡受体诱导的凋亡需要caspase 8介导的BCL-2家族蛋白BH3相互作用域死亡激动剂（BID）的切割，以激活线粒体作为凋亡信号的放大器。
7. 在内源性凋亡中，BCL-2家族蛋白触发线粒体外膜通透性（MOMP），导致线粒体内含物（如细胞色素c）释放到胞质溶胶。
8. 细胞色素c随后激活凋亡蛋白酶激活因子1（APAF1），后者反过来触发caspase 9的激活，随后是caspase 3和caspase 7的激活

Fig. 1: Extrinsic and intrinsic pathways to cell death.

• 外源性细胞死亡刺激因子可激活死亡受体，如肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）、FAS、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体1（TRAILR1）、TRAILR2或Toll样受体（例如，TLR4和TLR3）。
• 在FAS配体（FASL）或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的刺激下，死亡受体FAS、TRAILR1和TRAILR2通过死亡结构域（DD）介导的与FAS相关死亡结构域蛋白（FADD）的相互作用激活caspase 8，随后激活caspase 3和caspase 7，直接导致I型细胞凋亡。
• 在II型细胞中，caspase 8的激活效率较低，但通过caspase 8介导的BCL-2家族蛋白BH3相互作用域死亡激动剂（BID）裂解为截短的BID（tBID）来补偿，这通过内在途径启动凋亡。
• 肿瘤坏死因子（TNF）结合到TNFR1后，或者双链RNA（dsRNA）结合到TLR3，或脂多糖（LPS）结合到TLR4后，TNFR1的死亡结构域或含有TIR结构域的干扰素β诱导蛋白TRIF的RIP同型相互作用基序（RHIM）与受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1）的相应结构域相互作用，RIPK1作为支架并在称为复合物II或ripoptosome的蛋白质复合物中对细胞存活作出贡献。
• 在这个复合物内，细胞FLICE样抑制蛋白剪接变体L（cFLIPL）刺激caspase 8的次致死性激活，从而通过caspase 8介导的RIPK1、RIPK3和泛素羧基末端水解酶CYLD的裂解来促进细胞存活，这阻止了凋亡和坏死性凋亡。
• 在某些条件下，RIPK1可通过驱动RIPK3自磷酸化和激活来触发坏死性凋亡。
• TLR4、TLR3和Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）也可独立于RIPK1刺激RIPK3激活。
• 一旦被激活，RIPK3磷酸化并激活混合谱系激酶结构域样假激酶（MLKL），导致坏死性凋亡。
• 内在细胞死亡刺激因子激活BCL-2家族中的穿孔形成成员，包括BAX、BAK和BOK。
• 它们的激活受到促死BH3-only蛋白（如BIM、PUMA、BAD、NOXA和BMF）与促生存BCL-2家族成员BCL-XL、BCL-W、MCL1和A1之间平衡的调控，并最终导致线粒体外膜通透性（MOMP）增加以及诸如细胞色素c、第二线粒体来源的caspase激活因子（SMAC）或HTRA2等促凋亡因子的释放。
• 这些因子一旦释放，会增强或促进caspase 3和caspase 7的作用，导致细胞凋亡，即依赖caspase的细胞死亡。
• 此外，caspase介导的环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）和干扰素调节因子3（IRF3）的裂解抑制了一型干扰素反应及由线粒体DNA（mtDNA）在线粒体外膜通透性增加后进入胞质而产生的可诱导损伤相关分子模式（iDAMPs）的产生。
• ER，内质网；STING，干扰素基因刺激器。

1. 坏死性凋亡可以通过死亡受体、模式识别受体（PRRs）如Toll样受体（TLRs；例如，TLR4）和核酸传感器（例如，TLR3和Z-DNA结合蛋白1（ZBP1））的激活而被诱导。
2. 坏死性凋亡依赖于受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3（RIPK3）的激活，该激酶反过来磷酸化混合谱系激酶结构域样假激酶（MLKL）。
3. 尽管坏死性凋亡信号传导的确切机制尚未完全明了，但RIPK3介导的MLKL磷酸化触发了MLKL构象的变化，促进了其寡聚化、向细胞膜转位及破坏细胞膜，最终导致溶细胞性细胞死亡。
4. 对于RIPK3激活和坏死性凋亡信号传导至关重要的是其被招募至含有RIP同型相互作用基序（RHIM）的蛋白质。
5. RHIM是短而保守的蛋白质序列，它们介导RHIM:RHIM淀粉样纤维的形成，在其中通过自磷酸化激活RIPK3。
6. 在人类和小鼠中，已鉴定出四种含有RHIM的蛋白质：RIPK1、含TIR结构域诱导干扰素-β的适配器（TRIF）、ZBP1和RIPK3本身。
7. 将RIPK3通过RHIM依赖的方式招募到RIPK1、TRIF或ZBP1的RHIM上就足以触发RIPK3的激活和坏死性凋亡。

Fig. 2: Necroptotic signalling.

• 凋亡小体通路可由溶瘤病毒、病原体成分如脂多糖（LPS）和双链RNA（dsRNA；例如，Riboxxol或poly(I:C)）、以及死亡配体如肿瘤坏死因子（TNF）和TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL）触发，这些配体与死亡受体如肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）或Toll样受体（TLRs），包括TLR4和TLR3结合。
• 这些过程导致受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3（RIPK3）通过含有RIP同源相互作用基序（RHIM）结构域的蛋白质激活，如RIPK1、含TIR结构域的干扰素-β诱导适配器（TRIF）或Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）。
• 当胱天蛋白酶8（caspase 8）活性低、缺失或被抑制时，如对病毒抑制剂的反应、药理学抑制及遗传或表观遗传丢失，凋亡小体信号继续进行。
• 这是因为caspase 8通过裂解和失活促进凋亡小体的蛋白质来抑制凋亡小体细胞死亡，包括RIPK1、RIPK3和泛素羧基末端水解酶CYLD。
• 在可以刺激凋亡小体的途径中，TNF介导的TNFR1激活是凋亡小体信号启动的最佳理解机制。
• 凋亡小体依赖于混合谱系激酶结构域样（MLKL）伪激酶由RIPK3激活。
• RIPK3介导的MLKL磷酸化触发构象变化，这促进了寡聚化、泛素化、向细胞膜转位和破坏细胞膜，最终导致溶解性细胞死亡，使构成性的损伤相关分子模式（cDAMPs）和响应核因子-κB（NF-κB）和/或干扰素信号产生的可诱导DAMPs（iDAMPs）释放。
• MLKL的泛素化对于其有效转位到质膜热点区域是必需的。
• cIAP，细胞凋亡抑制蛋白；DD，死亡结构域；IKK，核因子-κB抑制剂激酶；LUBAC，线性泛素链组装复合物；MK2，图谱激酶-激活的蛋白激酶2；PRR，模式识别受体；SMAC，第二线粒体来源的caspase激活剂；TAK1，转化生长因子-β激活的激酶1。

1. 坏死性凋亡信号通路受到多种翻译后修饰的严格调控。
2. TNFR1途径是最早被发现的坏死性凋亡途径之一。
3. 受体结合后，RIPK1迅速被招募到一个与受体相关的复合物中。
4. 这个复合物被称为TNFR1信号复合体I，其中包含TNFR1相关死亡结构域蛋白（TRADD）、细胞抑制凋亡蛋白1（cIAP1）、cIAP2、TNFR相关因子2（TRAF2）、线性泛素链组装复合体（LUBAC）以及激酶复合体TAK1–TAB2–TAB3、IKKα–IKKβ–NEMO和TBK1–IKKε–TANK–NAP1等其他蛋白质。
5. 在TNFR1信号复合体I中，RIPK1被核因子-κB激酶亚基β（IKKβ）、TANK结合激酶1（TBK1）、转化生长因子-β激活的激酶1（TAK1）和丝裂原活化蛋白激酶激活的蛋白激酶2（MK2）磷酸化，并被cIAP1、cIAP2和LUBAC多泛素化。
6. 这些翻译后修饰有助于触发促炎性和促存活转录因子核因子-κB（NF-κB）及丝裂原活化蛋白激酶的激活。
7. 同时，RIPK1的这些磷酸化和泛素化事件也抑制了它从复合体I中的脱离。
8. 因此，如果RIPK1未能被泛素化或磷酸化，它可以从TNFR1信号复合体I中分离出来，与RIPK3、FAS相关死亡结构域蛋白（FADD）、细胞FLICE样抑制蛋白剪接变异体L（cFLIPL）和胱天蛋白酶8形成次级胞质复合体（复合体II）。
9. 复合体II的形成并不一定会导致细胞死亡，因为复合体II中RIPK1诱导的坏死性凋亡仍被胱天蛋白酶8的酶活性所抑制，胱天蛋白酶8能切割RIPK1、RIPK3和泛素羧基末端水解酶CYLD。
10. 因此，坏死性凋亡通常需要抑制胱天蛋白酶，因为胱天蛋白酶8的蛋白水解活性是这条细胞死亡途径的主要抑制因素。
11. 当胱天蛋白酶8活性丧失或受到抑制时（例如，在实验条件下通过抑制胱天蛋白酶或遗传去除FADD或胱天蛋白酶8，或生理条件下由病毒蛋白如CrmA或表达高水平剪接变异体cFLIPS的细胞），RIPK1会在复合体II中积累，触发RHIM依赖性的RIPK3招募和激活。
12. TRIF 和 ZBP1 的 RHIMs 也可以触发坏死性凋亡信号（图 2）。
13. TRIF 在例如 TLR3 或 TLR4 信号传导过程中充当多效性的接头蛋白。
14. 尽管最初定义为一种 DNA 结合蛋白，人们普遍认为 ZBP1 作为核酸传感器主要识别细胞中的替代左旋双螺旋 RNA 结构，称为 Z-RNA56。
15. 这类 Z-RNA 常常由病毒编码，被 ZBP1 的 Zα 域检测到以诱导细胞死亡并限制病毒传播。
16. 因此，ZBP1 是我们抗病毒免疫的重要组成部分。
17. 然而，Z-RNA 也可以从内源性逆转录元件特别是短散布核元件产生，如果异常产生，则可以被 ZBP1 感知并可能导致细胞死亡和炎症性疾病57,58,59。
18. TRIF 和 ZBP1 都能够在没有 RIPK1 的情况下启动坏死性凋亡60,61,62,63。
19. 实际上，RIPK1 似乎对 TRIF 依赖性和 ZBP1 依赖性的坏死性凋亡具有负调控作用。
20. RIPK1 至少部分通过将 caspase 8 招募到 TRIF 和 ZBP1 来介导这一效应，其中 caspase 8 切割并失活促进坏死性凋亡的蛋白质，包括 RIPK3、CYLD 和 RIPK1 自身。
21. 相应地，RIPK1 的 RHIM 发生突变的小鼠由于自发性坏死性凋亡而在胚胎发生期间死亡61,62。
22. 这种异常的坏死性凋亡是由 ZBP1 介导的，并且在较小程度上由 TRIF 介导61,62。
23. 此外，RIPK3 或 ZBP1 缺陷阻止了 Ripk1 和 Casp8 双敲除小鼠的出生后致死性，这表明 RIPK1 抑制 ZBP1 诱导的和 RIPK3 诱导的致命性坏死性凋亡61,64,65。
24. RIPK1 丢失触发 ZBP1 依赖性和 TRIF 依赖性坏死性凋亡的原因似乎是感知源自内源性逆转录元件和短散布核元件的双链 RNA（dsRNA）配体在小鼠细胞中。
25. 一致地，一种不能结合 Z-RNA 的突变型 ZBP1 蛋白无法在 Ripk1 敲除动物中驱动坏死性凋亡58,66
26. 最终，这些含有RHIM的蛋白质的主要作用是结合激酶RIPK3，并通过导致其寡聚化和自磷酸化来促进其自身激活。
27. 一旦激活，RIPK3结合、磷酸化并激活MLKL，形成类似淀粉样结构，这一结构被称为坏死体，是坏死性细胞死亡途径中的一个关键步骤。
28. MLKL包含一个N端四螺旋束（4HB）‘杀手’域、一个支撑结构和一个C端类激酶域。
29. 在稳态条件下，MLKL的伪激酶域作为锁扣限制4HB域的活动。
30. RIPK3介导的人类MLKL在Thr357和Ser358位点的磷酸化（或小鼠MLKL中的Ser345）触发了MLKL构象的变化，释放出4HB域。
31. 这促进了MLKL的寡聚化、膜转位和膜破裂。
32. 一种导致MLKL自发激活的错义突变，独立于RIPK3，促进了小鼠中由坏死性引起的致命新生炎症和造血功能障碍。
33. 尽管MLKL激活的初始步骤已相当明确，但其从被RIPK3磷酸化到寡聚化、转位以及插入质膜执行坏死性的具体过程仍然不完全清楚。
34. 虽然MLKL的磷酸化是坏死性信号传导的一个关键步骤和标志，但在MLKL向质膜转运的过程中还存在其他的调控点。
35. 除了磷酸化外，MLKL还需要在Lys219位点通过Lys63连接的泛素链进行泛素化，才能有效地在质膜上形成高级聚合物。
36. 此外，MLKL还通过高尔基体-微管-肌动蛋白依赖机制与紧密连接蛋白共运输。
37. 即便如此，MLKL仍不一定能发挥杀伤作用，因为它的活性可以通过泛素化和与flotillin以及所需的运输内吞分选复合体（ESCRT）机器的相互作用受到限制。

Immunological consequences of cell death

细胞死亡的免疫学后果

1. 目前的观点认为，细胞死亡并非终点，而是与组织微环境中的哨兵细胞沟通的开始，判断这种死亡是否可疑或无关紧要。
2. 因此，免疫学后果非常依赖于上下文（图3）。
3. 最终，免疫系统正在寻找诸如损伤相关分子模式（DAMPs）等线索。
4. 这些线索多种多样，从胞内蛋白和可诱导的细胞因子到基因组或线粒体DNA。
5. 检测这些线索的第一道障碍是，在凋亡过程中，大多数这些信息在未被评估前就已经被包裹起来。
6. 凋亡的胱天蛋白酶活性有助于产生新的找我信号（例如溶磷脂胆碱、鞘氨醇1-磷酸、CX3C趋化因子配体1（CX3CL1）和三磷酸腺苷）和吃我信号（例如磷脂酰丝氨酸、磷脂乙醇胺、细胞间黏附分子3（ICAM3）和钙网蛋白信号），这些信号提示其他细胞需要迅速清除凋亡细胞。
7. 胱天蛋白酶还可以直接或间接阻碍损伤相关分子模式的释放和产生，特别是基因组和线粒体DNA。
8. 因此，胱天蛋白酶可以使信号分子失活，如环鸟苷酸-环腺苷酸合成酶（cGAS）和转录因子干扰素调节因子3（IRF3），否则这些信号分子将驱动免疫原性细胞因子的产生。
9. 因此，凋亡通常是非免疫原性的，这是因为免疫原性信号被主动中和，而非不存在。
10. 如果凋亡过程未能妥善处理损伤相关分子模式，例如吞噬过程受阻或延迟，则可能变为免疫原性。
11. 这种情况已在癌症治疗中通过辐射或几种DNA损伤化疗药物或有丝分裂抑制剂观察到

Fig. 3: Apoptotic and necroptotic cells have differential effects on DC maturation and immune responses.

• 未成熟树突状细胞(DCs)吞噬死亡细胞使外周DC能够采样和处理抗原，并且刺激它们迁移到次级淋巴器官，在那里它们经历成熟过程并与初始T细胞相互作用(见框3)。
• 根据环境信号的存在与否，此类DC可成熟为耐受性或免疫原性的DC。
• 在没有感染的情况下吞噬凋亡细胞会触发耐受性DC的发育，通过与T细胞的相互作用(信号1)，这些DC可以重新编程T细胞进入静息状态或促进它们的消除。
• 与凋亡细胞或通过坏死死亡的细胞不同，死亡细胞激活坏死性信号通路可产生一个启动免疫信号(称为信号-1)，这可能导致外周DC向免疫原性命运的偏移。
• 该信号包括组成型相关分子模式(cDAMPs)和诱导型DAMPs(iDAMPs)，这些在细胞裂解时以高浓度释放到微环境中。
• cDAMPs是存在于死亡前但仅由死亡细胞释放的免疫刺激性细胞因子。
• 相反，iDAMPs是在响应坏死性信号传导级联激活而新合成的因素，同时驱动转录因子如核因子-κB(NF-κB)或干扰素调节因子3(IRF3)的激活，而在细胞承诺死亡的同时发生。
• 吞噬死亡细胞(信号0)加上cDAMPs和iDAMPs(信号-1)的存在导致免疫原性DC的成熟，这些DC能够驱动T细胞交叉启动。
• 将iDAMPs的产生与细胞死亡脱钩(未显示)会消除交叉启动和抗肿瘤免疫，证明了iDAMPs对于启动适应性免疫反应的重要性。
• 信号1是由吞噬死亡细胞后从抗原加工得到的主要组织相容性复合体(MHC) I类相关肽介导的抗原识别事件，通过T细胞受体(TCR)触发。
• 信号2是共刺激事件，由CD28与CD80和CD86结合介导。
• 信号3是由DC传递给T细胞的极化和分化信号，决定了它分化为效应细胞。
• CD40L：CD40配体；CTL：细胞毒性T淋巴细胞；LPS：脂多糖；TNF：肿瘤坏死因子

1. 因此，鉴于凋亡作为一种免疫原性细胞死亡形式的相关研究越来越多（参见方框2），为什么不依赖"免疫原性"凋亡来对抗癌症呢？
2. 如上文所述及方框2中详细解释的那样，凋亡的免疫原性始终受限于由半胱天冬酶介导的免疫信号失活以及由半胱天冬酶介导的吞噬过程激活，这一过程将潜在的信号封闭起来。
3. 与凋亡不同，坏死性凋亡信号不仅触发死亡诱导蛋白的激活和组装，同时还能转录性地诱导危险信号，这些信号在裂解性细胞死亡时最有效地释放到组织微环境中。
4. 尽管免疫原性凋亡已在临床实践中证明了其价值，但考虑其他的免疫原性细胞死亡形式，如坏死性凋亡，也是值得的，特别是因为坏死性凋亡可以自然引发免疫反应。
5. 后者之所以可能是因为坏死性凋亡诱导策略模拟了入侵病原体的影响，从而模仿了感染。
6. 因此，利用坏死性凋亡的抗肿瘤方法不仅能导致肿瘤细胞死亡，还能通过驱动对肿瘤抗原的免疫化来促进免疫反应。
7. 在考虑坏死性凋亡的免疫原性时，必须区分坏死性凋亡信号（由TNFR1、TRIF或ZBP1介导的RIPK1或RIPK3激活）与坏死性凋亡执行（MLKL介导的细胞破裂）（图2）。
8. 虽然似乎直观上认为，死亡的坏死性凋亡细胞破裂比保持质膜完整的凋亡细胞更具有免疫原性，但单纯细胞裂解并不是使坏死性凋亡事件更具免疫原性的原因。
9. 实际上，长期以来人们已经知道，在经过反复冻融循环后发生意外坏死的细胞，在机械破坏细胞后并不能引起免疫反应，当用于给小鼠接种疫苗时失败了。
10. 虽然执行阶段（即膜破裂）对坏死性凋亡的免疫原性有所贡献，但上游信号事件同样重要。
11. 事实上，使用RIPK3二聚化来触发坏死性凋亡的研究表明，坏死性凋亡免疫原性的核心来源取决于RIPK1和NF-κB在死亡细胞中的信号传递。
12. RIPK1因此有助于DAMPs的转录诱导，随后通过细胞裂解释放。
13. 此外，许多导致RIPK1和RIPK3激活的情况也会驱动干扰素信号传导，这进一步促进了坏死性凋亡细胞的免疫原性。
14. 例如，TRIF和ZBP1不仅激活RIPKs，而且还同时通过激活TBK1来促进I型干扰素的产生，TBK1磷酸化并激活转录因子IRF3和IRF7。
15. 两种干扰素信号传导和NF-κB激活最终推动了可诱导DAMPs(iDAMPs)的产生。
16. 因此，来自坏死性凋亡细胞的信号包括构成性DAMPs(cDAMPs)，这些是免疫刺激性细胞因子，是预先形成的分子，在死亡前就存在，并且未经改变地由死亡细胞释放；以及iDAMPs，这些因素通过依赖于潜在细胞死亡途径的机制被主动转录诱导和/或翻译后加工。
17. 尽管iDAMPs的种类正在迅速发展，但很明显它们是由NF-κB和干扰素诱导的，并触发肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子的产生、免疫吸引剂CC-趋化因子配体2(CCL2)、CX-趋化因子配体9(CXCL9)、CXCL1和CXCL8，以及IL-6和IL-1家族成员，和I型干扰素的产生。
18. 免疫原性细胞死亡的一个关键决定因素是树突状细胞对死亡或垂死细胞的吞噬（图3和框3）。
19. 这使得抗原能够递送到抗原呈递细胞的主要组织相容性复合体（MHC）I类分子上105。
20. 坏死细胞内的NF-κB信号可以引发诸如CCL2、CXCL1、CXCL8和CXCL9等"找我"信号。
21. 正如上文所述，显著的‘吃我’信号包括暴露于细胞表面的磷脂。
22. 重要的是，吞噬凋亡细胞能通过上调诸如TGFβ和IL-10等因素，在树突状细胞中触发免疫抑制性的转录程序，从而防止对稳态细胞周转凋亡产生免疫反应106,107。
23. 与凋亡细胞死亡不同，坏死性细胞死亡本质上能触发树突状细胞的激活和成熟，使这些抗原呈递细胞即使在没有感染的情况下也能启动免疫反应85,100。
24. 来自坏死细胞的免疫原性信号中的关键成分是危险相关分子模式（DAMPs），它们被树突状细胞上的适当受体感知，并进而刺激适应性免疫反应108,109,110。
25. 虽然来自垂死细胞的胞外DAMPs可以刺激树突状细胞表面的模式识别受体（PRRs），诱导其成熟并促进细胞因子释放111，但仅胞外DAMPs不足以诱导有效的交叉启动100。
26. Yatim等人100的研究显示，垂死细胞的激活状态决定了其免疫原性。
27. 他们使用RIPK3二聚化作为触发器来驱动‘纯’坏死性死亡，发现抗原供体细胞内固有免疫途径（如MAPK和NF-κB信号）和细胞死亡途径的耦合激活调节了抗原交叉呈递的结果。
28. 相应地，将NF-κB信号从坏死性死亡中分离出来会降低CD8+ T细胞交叉启动的效率和抗肿瘤免疫力85,100。
29. 胞外DAMPs和胞内DAMPs的组合为免疫原性混合物带来了必要的佐剂活性，确保抗原呈递细胞，如树突状细胞和组织驻留巨噬细胞，不仅吞噬死亡细胞以呈递癌症表位，同时还能被激活以促进CD8+ T细胞交叉启动8。
30. 人们认为，胞内DAMPs的新转录诱导反映了细胞遇到感染或组织损伤时参与的各种压力途径，为随后触发免疫反应的抗原呈递细胞提供了精细调节的信号85
31. 在坏死性凋亡过程中，iDAMPs的产生依赖于RIPK1、TRIF和ZBP1介导的NF-κB激活以及干扰素信号传导，因此发生在细胞裂解之前。
32. 重要的是，细胞裂解似乎并不能阻止iDAMPs的产生，因为只要内质网仍然完整，即使细胞膜完整性已经丧失，至少在短时间内，细胞因子合成仍可继续进行。
33. 一些cDAMPs也可以促进iDAMPs的产生。
34. 例如，断裂的核DNA或线粒体DNA的释放激活了cGAS，进而触发死亡细胞及组织或肿瘤微环境中细胞中的干扰素基因刺激物(STING)途径，导致I型干扰素的产生。
35. 由于NF-κB和干扰素信号传导也能刺激TRIF的表达，同时还能刺激TLR3、ZBP1和MLKL的表达，它们的诱导形成了一个正反馈环路，确保了免疫原性。
36. 总体而言，坏死性凋亡信号的本质可能旨在最大化危险信号及趋化因子的产生和释放，向免疫系统发出紧急求救信号，最终促进树突细胞迁移、吞噬作用、抗原处理与MHC加载、成熟以及抗原交叉启动。
37. 这与观察到的现象相呼应，即坏死性凋亡细胞可通过吞噬细胞增强CD8+ T细胞的交叉启动，而凋亡细胞通常由于凋亡酶介导的免疫原性信号失活而不产生影响。（图3和框2）
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Pharmacological modulation of necroptosis

1. 坏死性凋亡的免疫刺激特性使其成为癌症治疗中的一个吸引人的选择。
2. 它的免疫原性与免疫检查点抑制剂（ICIs）相结合，可能会使冷肿瘤更容易受到免疫浸润，并希望最终能够消除癌症。
3. 将这一理论转化为实践需要有可靠的药理学化合物，这些化合物可以在临床中使用，并且在可行的治疗策略内。
4. 在本节中，我们描述了目前可用的化合物以及如何可靠地控制体内坏死性凋亡的使用方法。

Necroptosis inducers in cancer treatment

在癌症治疗中的坏死性凋亡诱导剂

1. 为了在体内药理学上诱导坏死性凋亡，必须抑制第八型胱天蛋白酶，否则它会强烈地抑制坏死性凋亡。
2. 除了激活坏死性凋亡的潜力外，抑制胱天蛋白酶对于癌症治疗具有吸引力，因为它可以增强细胞死亡的免疫原性。
3. 虽然胱天蛋白酶在凋亡过程中被激活，但它们对于执行细胞死亡并非必不可少——它们的作用是加速细胞死亡，并调节几个关键过程以确保有效吞噬，包括产生找我信号以招募巨噬细胞、吃我信号以促进吞噬过程，以及释放抗炎介质作为增强免疫耐受性和抗炎反应。
4. 因此，如果由于线粒体破裂而激活了胱天蛋白酶，如内在凋亡途径中那样，抑制胱天蛋白酶很少足以阻止细胞死亡，因为线粒体通透性转换孔的形成无论如何都会杀死细胞。
5. 因此，在癌症治疗中抑制胱天蛋白酶很可能不会干扰通过内在、线粒体途径依赖于线粒体通透性转换孔形成的癌细胞杀伤。
6. 这种在没有胱天蛋白酶的情况下进行的由线粒体通透性转换孔诱导的细胞死亡通常被称为非胱天蛋白酶依赖性的细胞死亡。
7. 在缺乏胱天蛋白酶活性的情况下细胞死亡免疫原性增加的原因包括不存在胱天蛋白酶介导的损伤相关分子模式的切割和中和。
8. 此外，在没有胱天蛋白酶活性的情况下，线粒体更易于泄漏其DNA，从而激活cGAS-STING介导的干扰素信号传导。
9. 进一步地，第二线粒体来源的胱天蛋白酶激活因子（SMAC；也称为DIABLO）和其他携带IAP结合基序的类似SMAC蛋白质从线粒体释放到胞质中，通过抑制cIAPs驱动NF-κB活化和iDAMPs的产生。
10. 因此，在非胱天蛋白酶依赖性细胞死亡期间，干扰素信号传导和NF-κB活化相结合可引起强烈的免疫反应。
11. 在临床使用的胱天蛋白酶抑制剂中，尽管存在一些局限性，埃姆里卡桑仍然是最有前景的一种。
12. 它对胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶1具有很强的抑制作用，并且对胱天蛋白酶3也有适度的抑制效果。
13. 它已进入非酒精性脂肪性肝炎治疗的三期临床试验。
14. 尽管试验未能显示患者的真实改善情况，但它证明了埃姆里卡桑能够结合其目标分子并且安全、耐受性良好。
15. 不幸的是，埃姆里卡桑被肝脏迅速过滤掉。
16. 然而，研究表明，将埃姆里卡桑与SMAC模拟物联合使用可以诱导混合系白血病（MLL，也称为KMT2A）易位的急性髓系白血病（AML）发生坏死性凋亡，并显著提高携带MLL-ENL易位白血病小鼠的存活率。
17. 机制上，SMAC模拟物与cIAPs结合后能激活它们的泛素E3连接酶活性，触发cIAPs自身泛素化及降解。
18. 由于IAPs控制RIPK1从TNFR1信号复合体I向胞质复合体II的转换以及其细胞毒性潜能，因此使用SMAC模拟物去除这些E3连接酶是一种有效的、常用于实验中触发RIPK1激活的方法。
19. 与埃姆里卡桑联用后，RIPK1的细胞毒性潜能转向激活RIPK3及RIPK3介导的坏死性凋亡。
20. 虽然可用于实现IAP耗尽和RIPK1激活的临床级别的SMAC模拟物，如比林纳潘特、Debio 1143、LCL-161和托利纳潘特等（在别处进行了综述），但尚未在临床上测试过SMAC模拟物与埃姆里卡桑的组合。
21. 然而，在预先临床设置中，单独使用比林纳潘特就能在急性淋巴母细胞白血病患者的样本中诱导出依赖于RIPK1的凋亡和坏死性凋亡。
22. 比林纳潘特与埃姆里卡桑的联合治疗在急性髓系白血病患者的样本中以及在小鼠体内诱导出依赖于TNF的坏死性凋亡，显示出高度有效性。
23. 这种药物组合在小鼠中耐受性良好，这让人寄希望于在人体中诱导坏死性凋亡也可能被耐受。
24. 在实验模型中，SMAC模拟物与泛胱天蛋白酶抑制剂联合使用也能有效杀死其他类型的癌症，例如纤维肉瘤或胰腺癌细胞
25. 使用SMAC模拟物诱导RIPK1依赖性坏死性凋亡的一个局限在于，这一过程需要肿瘤坏死因子的存在。
26. 虽然SMAC模拟物处理可以导致某些癌细胞自分泌产生肿瘤坏死因子，但并非总是能够做到。
27. 全身给予肿瘤坏死因子是不可能的，因为它会导致严重的类似脓毒症休克的不良反应。
28. 然而，对于不适合手术切除的肢体恶性肿瘤，如软组织肉瘤，通过孤立肢体灌注将肿瘤坏死因子仅输送到患者受影响的肢体，可以避免治疗限制性的毒性。
29. 这种应用肿瘤坏死因子的方法，通常与化疗药物美法仑联合使用，是目前这类不可手术恶性肿瘤的标准治疗方法。
30. 尽管是一个具有挑战性的环境，但在一项预临床孤立肢体灌注研究中成功地使用了SMAC模拟物来促进RIPK1驱动的免疫源性细胞死亡，并增强了治疗效果。
31. 虽然在其他情况下给予肿瘤坏死因子可能不切实际，但有可能利用肿瘤微环境中升高的肿瘤坏死因子水平。
32. 因此，SMAC模拟物可能与炎症环境协同作用，无论是诱导还是其他方式产生的，以引发癌细胞死亡。
33. RIPK1驱动的坏死性凋亡也可以独立于TNF被触发，并且可以通过SMAC模拟物增强。
34. 虽然这种方法尚未进入临床试验阶段，但TNF相关的凋亡诱导配体（TRAIL）能够在体外广泛范围的癌细胞中激活RIPK1并诱导坏死性凋亡，作为单一药物或与SMAC模拟物联合使用时，能够减少这些细胞的克隆生存能力。
35. DNA损伤剂，如依托泊苷或纺锤体毒素，也能触发RIPK1激活以及RIPK1介导的坏死性或凋亡性细胞死亡。
36. SMAC模拟物与其他化疗药物的组合还包括糖皮质激素、阿糖胞苷、去甲基化剂（例如，5-氮杂胞苷或5-氮杂-2'-脱氧胞苷）或组蛋白脱乙酰酶抑制剂（包括MS275、LBH589和SAHA）。其中一些组合在加入胱天蛋白酶抑制剂时已被证实能诱导坏死性细胞死亡。
37. 此外，在肿瘤携带FADD或胱天蛋白酶8突变的情况下，仅使用SMAC模拟物可能就足以推动细胞进入坏死性凋亡。
38. 相应地，在携带腺瘤性息肉病（Apc）基因突变的杂合小鼠中，对胱天蛋白酶8缺陷的结直肠癌进行SMAC模拟物治疗导致已建立肿瘤的消退，这一现象也在异种移植小鼠模型中得到证实。
39. 除了SMAC模拟物之外，TLR3激动剂与caspase抑制剂联合使用也被用来在体内触发坏死性凋亡。
40. 这些化合物是基于双链RNA结构如聚(I:C)的衍生物、类似物或概念化产物。
41. 临床可用药物包括稳定的聚(I:C)希尔顿醇、纳米复合化的聚(I:C) BO-112、聚(I:C)类似物安普利金、合成双链RNA里博克斯醇和双链RNA模拟物ARNAX。
42. 通过ZBP1介导的坏死性凋亡激活也可能是一种驱动免疫原性细胞死亡的有希望的方法。
43. 最近的证据表明，药物Curaxin CBL0137可以通过在细胞内触发Z-DNA形成来强力激活ZBP1。
44. CBL0137在癌症相关成纤维细胞中诱导ZBP1依赖性的坏死性凋亡，并在黑色素瘤小鼠模型中逆转了ICI治疗的无效性。
45. 同一研究还强调，作用于双链RNA的腺苷脱氨酶1(ADAR1)，一个已知的对ICI治疗抵抗性的决定因素，会抑制内源性的Z-RNAs，否则这些Z-RNAs将驱动ZBP1介导的坏死性凋亡。
46. 因此，开发ZBP1激动剂或ADAR1抑制剂可能代表着增强ICI抗性人类癌症免疫反应性的有前景的方向。
47. 虽然RIPK1可以在某些条件下驱动坏死性凋亡，例如在FADD或caspase 8的基因缺失或caspase 8的药理学抑制下，但RIPK1的主要生理作用似乎是抑制由TRIF和ZBP1驱动的坏死性凋亡。
48. 因此，RIPK1的基因缺失加剧了对TLR3或TLR4和ZBP1激活所引发的坏死性凋亡信号。
49. 此外，最近的数据表明，癌细胞常常劫持RIPK1以促进细胞生存并对免疫疗法产生抗性。
50. 重要的是，RIPK1的支架功能似乎负责增强细胞生存能力和产生免疫抑制性趋化因子程序，最终导致CD8+ T细胞和自然杀伤细胞的浸润减少，从而引起对免疫检查点阻断的显著抵抗。
51. 因此，靶向RIPK1可能是另一种吸引人的方法来激发坏死性凋亡反应。
52. 因此，在小鼠B16-F10黑色素瘤和TSA乳腺癌模型中RIPK1的基因缺失改变了免疫细胞图谱，并导致ICI疗效提高。
53. 机制上讲，在癌细胞中删除RIPK1减少了ARG1+抑制性髓系细胞的积累，并导致它们被表达高水平MHC II类和CXCL9的巨噬细胞替代，CXCL9是一种对于细胞毒性淋巴细胞招募重要的趋化因子，指示抗肿瘤表型。
54. 由于RIPK1的支架而非激酶功能似乎控制着对ICI抵抗重要的免疫抑制性趋化因子和细胞生存信号，因此克服对PD1和/或CTLA4治疗的抵抗将需要RIPK1的降解而不是抑制

Limitations of necroptosis as an anticancer therapy

necroptosis作为抗癌疗法的局限性

1. 如果能在肿瘤中特异地诱导出坏死性凋亡，正如上文所述，这将作为一种抗癌疗法具有多个吸引人的特点。
2. 它既能同时杀死对凋亡有抵抗力的癌细胞，又能促进免疫反应。
3. 鉴于这种前景，要将坏死性凋亡疗法转化为临床应用，还需要克服哪些障碍呢？
4. 第一个挑战是缺乏可靠的标记物来区分体内凋亡和坏死性凋亡。
5. 虽然检测RIPK3和MLKL磷酸化形式的抗体常被用于检测组织切片中活性RIPK3和MLKL的存在，但它们的活性形式也可能出现在主要死亡形式为凋亡或焦亡的细胞中，或者出现在由于坏死性凋亡执行被否定而存活下来的细胞中，即便MLKL已经磷酸化。
6. 此外，RIPK3不仅作为坏死性凋亡途径中的关键角色发挥作用，在特定条件下，RIPK3还能触发依赖于RIPK1和caspase 8介导的外源性凋亡。
7. 因此，尽管RIPK3处于坏死性细胞死亡途径的核心位置，激活状态下的RIPK3信号网络可能与RIPK1重叠。
8. 公认的物种特异性差异也使得将实验模型生物中的观察结果转化为人类情况变得困难。
9. 虽然小鼠和人类都保留了参与坏死性凋亡的能力，但这两个物种以略有不同的方式参与这种溶细胞形式的死亡。
10. 例如，小鼠MLKL在Ser345位点由RIPK3介导的磷酸化足以引发构象变化，促进寡聚化、向细胞膜的转位以及细胞膜的破坏，最终导致溶细胞死亡。
11. 虽然RIPK3介导的MLKL磷酸化也是人类坏死性凋亡中的一个必要检查点，但这还不足以激活它，因为除了MLKL磷酸化之外，还需要稳定的将人MLKL招募到RIPK3。
12. 因此，仅通过磷特异性抗体检测磷酸化的MLKL不能作为人体内发生坏死性凋亡的证据。
13. 在临床前实验环境中，可以进一步使用药理学或遗传学手段证实坏死性凋亡的发生。
14. 然而，在非实验环境中，如患者活检样本中，这通常是不可能的。
15. 相反，需要一个多因素验证方法（例如，额外验证MLKL向膜的转位）来可靠地区分临床样本中的坏死性凋亡与凋亡。
16. 第二个挑战在于癌细胞中可能抑制了坏死途径的某些成分，因为如果没有这些成分的表达，就不能发生坏死。
17. 在一个包括人类细胞系面板的筛选中，发现RIPK3经常通过启动子高甲基化的表观遗传机制在癌细胞中被沉默。
18. RIPK3的丢失或减少表达已在多种癌症中报道，包括急性骨髓性白血病、黑色素瘤、乳腺癌和结直肠癌。
19. 使用SMARTapp分析癌症基因组图谱（TCGA）数据库揭示，在前列腺癌、肝细胞癌和肾癌以及儿科低级别胶质瘤、肉瘤和黑色素瘤等实体肿瘤中，RIPK3启动子的高甲基化非常显著。
20. 然而，在这一数据集中，与正常组织相比，只有在前列腺癌、肾乳头状细胞癌和肝癌中，RIPK3启动子甲基化的增加才特别明显。
21. 有趣的是，其他一些癌症如膀胱癌和子宫内膜癌显示了一种不同的情况，这些癌症类型的RIPK3启动子甲基化模式与正常组织相比显著降低，这表明RIPK3启动子的沉默似乎不是致癌作用的一般规律，因此它可能不是癌症发展中的一个检查点。
22. 显然，还需要做更多的工作来更普遍地理解RIPK3启动子沉默在癌症中的重要性。
23. 一个重要问题是是否存在失去RIPK3表达的选择压力，以赋予肿瘤生存优势和逃避免疫检测的能力，或者这种丢失是否反映了癌症的起源组织和细胞。
24. 可能最好的证据是癌症有时会选择RIPK3的缺失，这来自骨髓性白血病，其中几种亚型表现出RIPK3表达的显著下降。
25. 当在小鼠骨髓移植模型中重现这种RIPK3的缺失，该模型模拟了feline McDonough肉瘤样酪氨酸激酶3-内部串联重复（FLT3-ITD）驱动的骨髓增生性疾病时，不仅抑制了坏死，而且还阻止了炎症体的激活和所需细胞因子的产生，这些细胞因子对于白血病起始细胞的分化至关重要。
26. 因此，炎症体激活失败和细胞死亡促进了白血病起始细胞的积累，并加速了白血病的发生。
27. 从治疗角度来看，RIPK3表达的表观遗传丧失也可以被逆转。
28. 因此，给予去甲基化剂，如地西他滨、组蛋白脱乙酰酶或EZH2抑制剂可以恢复RIPK3的表达，并重新使癌细胞对坏死敏感，这一点已在多种癌细胞系中得到证明。
29. 在黑色素瘤中抑制BRAF和受体酪氨酸激酶AXL也能达到同样的效果，这可能是通过调控一组控制RIPK3在肿瘤发生期间表达的转录因子实现的。
30. 实验数据和患者数据显示，肿瘤细胞可以通过下调RIPK3、失去MLKL或CYLD来进化以逃避坏死性破坏。
31. 例如，在38%和4%的前列腺癌以及67%和2%的雌激素受体阳性乳腺癌中观察到一个或两个MLKL等位基因的丢失。
32. 这可能因这些癌症中16q21-24染色体区域的脆弱性而加剧，该区域通常在这些癌症中丢失。
33. MLKL水平低下已与胰腺导管腺癌、结肠癌和宫颈鳞状细胞癌患者的总体生存率下降相关联。
34. 尽管在某些癌症亚型中MLKL的表达可能较低，但其表达很容易通过治疗手段提升。
35. 例如，触发干扰素反应的治疗方法，如暴露于STING的药理学激动剂或放疗，可以促进MLKL的诱导，MLKL是一个显著的干扰素反应基因，从而使细胞变得易感于坏死。
36. 使用诱导坏死性凋亡药物作为抗癌疗法面临的第三个潜在挑战是炎症反应可能会促进肿瘤生长。
37. 由坏死性凋亡招募的炎性细胞可以通过促进血管生成、帮助癌细胞增殖和加速癌症转移来促进肿瘤发展。
38. 然而，这不太可能是坏死性凋亡特有的情况，因为任何有效的诱导细胞死亡策略都会促进炎症，而这同样可能刺激肿瘤生长。
39. 因此，将是一场竞争，看哪一方胜出；一个很好的例子最近在肝脏中得到了证明，在那里低水平的坏死体激活促进了肝癌的发生。
40. 因此，在生理上表达低水平RIPK3的肝细胞中，同时激活RIPK3和NF-κB导致慢性坏死体激活，但这并未导致立即的细胞死亡。
41. 相反，这些细胞进入了一个延长的‘亚致死’状态，膜通透性增加，作为分泌细胞释放促有丝分裂和炎症相关的DAMPs（如CCL20和CCL2，也称为MCP1）；这反过来触发了补偿性的增殖和肿瘤支持性单核细胞衍生巨噬细胞的激活，最终促进了肝癌的发生。
42. 通过抑制NF-κB将这种亚致死性坏死性凋亡转化为致命版本，限制了免疫反应并阻止了炎症和肝癌的发生。
43. 因此，药理学重编程亚致死性和致命性形式的坏死性凋亡之间可能代表了一种对抗肝细胞癌的有前景的策略。
44. 另一个要考虑的因素是肿瘤的免疫景观以及免疫细胞浸润的程度是否会影响坏死性凋亡癌细胞的免疫原性。
45. 目前关于肿瘤的免疫状态如何影响坏死性凋亡后抗肿瘤免疫反应的信息很少；然而，很可能免疫学上‘热’的肿瘤更容易对坏死性凋亡产生响应。
46. 此外，尚不清楚坏死性凋亡是否能够重新激活耗竭的T细胞。
47. 第四个挑战是使用胱天蛋白酶抑制剂。
48. 一项研究表明，在凋亡被胱天蛋白酶抑制阻断后，一部分来源于患者的急性髓系白血病细胞存活率更高。
49. 这可能是由于这些细胞中缺乏坏死性凋亡机制所致。
50. 然而，另一项研究显示，由诱导凋亡（使用凋亡诱导因子TRAIL）和随后诱导坏死性凋亡（使用TRAIL与广谱胱天蛋白酶抑制剂zVAD-fmk结合）组成的连续治疗方案，无论是按此顺序还是相反顺序进行，在体外对结肠癌和胆囊癌细胞的杀伤效果显著，这种效果是单独重复进行凋亡治疗所达不到的。
51. 因此，这种连续诱导坏死性凋亡和凋亡的策略可能可以克服与胱天蛋白酶抑制相关的部分问题。
52. 或者，可以通过增加坏死性凋亡信号或直接激活坏死性凋亡机制来避免抑制胱天蛋白酶。
53. 例如，一些研究团队已经证明，混合谱系激酶样蛋白（MLKL）的表达会被炎症刺激诱导；但是需要注意的是，仅仅上调MLKL并不意味着细胞将通过坏死性凋亡死亡。
54. 因此，这一策略可能还需要其他信号，如干扰素的产生。
55. 如上所述，干扰素（包括I型和II型）能够刺激MLKL的表达，并降低触发坏死性凋亡的阈值。
56. 因此，可能需要干扰素诱导剂，如STING、TLR或RIG-I激动剂，以绕过使用胱天蛋白酶抑制剂的需求或是增强响应效果。
57. 第五个挑战是控制不良影响。坏死性凋亡对微环境产生的深刻破坏作用可能导致不希望发生的后果，因为长期的炎症信号传导可能会导致病理变化或肿瘤发生。
58. 因此，坏死性凋亡与炎症性皮肤病、炎症性肠病、肝细胞癌和克罗恩病的发病机制有关，这表明基于坏死性凋亡的抗癌疗法可能导致患者出现不希望发生的炎症损伤。
59. 然而，癌症患者的短暂治疗使得这类副作用不太可能发生，因为可以避免坏死性凋亡的慢性激活。
60. 理想情况下，患者可以通过靶向疗法来治疗，这些疗法选择性地诱导癌细胞的坏死性凋亡，同时对正常细胞和组织的影响最小。
61. 然而，这类疗法（例如，肿瘤特异性递送光遗传学或药物诱导的坏死性凋亡激活剂）的发展仍处于起步阶段。
62. 使用坏死性凋亡可能带来的最大风险同时也是它最大的优势：其促炎性质。
63. 例如，当稳态机制无法清除死亡细胞时，即使是被认为比坏死性凋亡细胞更少引发炎症的凋亡，也可能发生潜在致命的炎症反应——肿瘤溶解综合征。
64. 在使用高剂量诱导凋亡的BCL-2模拟物venetoclax的早期试验中观察到了这一现象，但通过从较低剂量开始治疗就可以很好地管理。
65. 或者，潜在的不良影响也可以通过IL-6拮抗的帮助在临床上得到管理。
66. 因此，诱导坏死性凋亡的药物可能也能得到类似的管理。
67. 目前，预临床评估显示，促进坏死性凋亡的治疗组合似乎耐受良好。
68. 然而，更重要的是，尚不清楚这种刺激针对癌症的免疫反应的方法是否会增加诱发自身免疫反应的可能性。
69. 免疫检查点抑制剂已经与免疫相关不良事件(irAEs)的可能性相关联，尽管显然不是理想的，但对于一些患者来说，这些事件至少可以在临床上得到管理。
70. 如果将诱导坏死性凋亡的药物或策略与免疫检查点抑制剂结合使用，这个问题可能会更加严重。
71. 不幸的是，由于小鼠很少经历irAEs，因此很难在模型系统中研究由坏死性凋亡引起的irAEs

Concluding remarks and perspectives

1. 在这篇综述中，我们概述了利用坏死性凋亡作为杀死癌症策略的优点和潜在陷阱。
2. 诱导坏死性凋亡是一种前景广阔的新型治疗方式，它有可能引导免疫系统靶向肿瘤细胞。
3. 然而，如果要在临床应用这项技术，还需要解决一些悬而未决的问题。
4. 首先，为了分析坏死性凋亡诱导对肿瘤组织的影响，必须具备一套工具来明确可视化坏死性凋亡细胞及损伤相关分子模式的释放。
5. 通过专注于坏死性凋亡标志物和特定免疫浸润的组织病理学染色以及血液和活检中细胞因子的检测来开发此类工具至关重要。
6. 其次，哪些患者应该接受这种治疗？
7. 有些肿瘤可能无法通过坏死性凋亡死亡，因为它们缺乏坏死性凋亡途径中的关键成分。
8. 因此，根据癌细胞是否表达坏死性凋亡机制来对患者进行分层可能是一个诱人的选择。
9. 相反，临床前研究表明，可能不需要直接诱导癌细胞发生坏死性凋亡。
10. 仅仅诱导基质细胞发生坏死性凋亡就足以吸引免疫细胞的募集和激活。
11. 事实上，只要微环境中的细胞激活坏死性凋亡信号通路，就可以观察到效果。
12. 渗透的抗原呈递细胞在接收来自坏死性凋亡细胞的必需佐剂（cDAMPs和iDAMPs）的同时，不可避免地也会取样邻近癌细胞的新抗原，从而使其成熟为交叉启动能力的树突状细胞。
13. 因此，触发抗原呈递免疫细胞成熟的危险信号不一定需要来自正在死亡的肿瘤细胞本身。
14. 所需要的只是同一抗原呈递细胞同时遇到肿瘤抗原和DAMPs。
15. 抗原回收（吞噬作用）与树突状细胞表面PRR刺激（cDAMPs和iDAMPs）的协同作用使树突状细胞成熟并有效促进T细胞交叉启动。
16. 因此，在等式中包括微环境的组成、组织结构和免疫景观，并考虑由肿瘤微环境中坏死性凋亡触发的情境依赖性炎症信号或免疫抑制效应可能导致免疫逃逸和肿瘤进展非常重要。
17. 理论上，坏死性凋亡可以很好地与检查点抑制免疫疗法相结合，但正如讨论的那样，可能存在增加irAEs的风险。
18. 然而，目前许多患者对免疫疗法没有反应，原因尚不清楚。
19. 我们必须预计在诱导坏死性凋亡方面也会遇到类似的挑战。
20. 最后，也是最实际的问题，我们如何将坏死性凋亡诱导与现有的治疗方法整合？
21. 大多数新疗法最初是在患者中与现有疗法结合使用的。
22. 确定哪些当前的标准治疗方案最有可能与坏死性凋亡诱导方案协同作用，而又不会引发难以忍受的炎症反应，将有助于这类治疗进入临床实践。
23. 我们概述了诱导坏死性凋亡治疗癌症的巨大潜力，特别是作为免疫中心方法的一部分，但为了实现这一潜力，我们需要预见、测试并解决面临的挑战

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