A4: 蛋白质组搜库--安装，建库，搜库，整合，分析

搜库前准备

搜库前应重装系统，清空不必要的东西，可在服务器A4, A5重装win7 PE版本（自带U深度PE装机工具）;安装完后需要激活一下win7

安装，均在A4服务器的C盘

apache(一个网络服务器)安装:D:\Program\Proteome\MASCOT_v2.3
点击exe安装, 填写邮箱名可以是假的，但必须跟后面保持一致（如66@.com）；登录localhost时（http://127.0.0.1/）出现 it works！为安装成功
Perl x64 语言安装（Mascot是基于Perl语言编写的）
D:\Program\Proteome\MASCOT_v2.3
3.Mascot x64 安装:D:\Program\Proteome\MASCOT_v2.3
安装时，要找到安装包内的mascot.licence 的具体路径，将其粘到指定的licence 框内
mascot.licence 的具体路径: D:\Program\Proteome\MASCOT_v2.3

为了让apache读懂Mascot，需要将/MASCOT/ 文件夹内的httpd.config文件中的全部内容，黏贴到/apache/文件夹内的httpd.config文件尾部，保存后重新打开apache，restart一下apache，再刷新Mascot网页。成功则可看见Mascot 网页的相关搜库内容。
PS: 若刷新网页失败，多半是因为apache没有被打开，或重启成功，多重启尝试则可！

4.Netframework 安装
为了可对搜库进行批量操作，需要使用Daemon，但Daemon安装前，需要安装Netframework 4.5版本，Netframework在此类似JAVA，用于解释.exe软件
存放路径：D:\Software\Drivers\Package\NetFramework
PS: 1. Netframework 4.5用于win 7电脑；若在win10 上安装Daemon，则不需要安装Netframework

Daemon 安装（也称Mascot Daemon）D:\Program\Proteome\MASCOT_v2.3
Daemon可对搜库进行批量操作。
Scaffold安装 D:\Program\Proteome\Q+S
1）重装服务器后，本机的时间需要该licence的时间，安装时将licence 粘进对应的框（sn.txt文件为licence）
2）在【控制面板】，进入【防火墙】，高级设置，选【出站规则】，【新建规则】，选【程序】，将Scaffold文件夹下的 jre/bin/javaw.exe block掉，选【阻止连接】，再随便重命名一下
c:/program file/scaffold 4

MASCOT搜库

peptide Mass Fingerprint 是按蛋白的KD数进行搜库；
单个Raw文件可在Ions Search进行搜库，但前提需要将raw文件的.wiz格式转为mgf格式
3.搜库前建库：
1）可在uniprot上下载所需的物种参考氨基酸序列：
在Taxonmy下，选view protein，选择Swiss prot(这个参考序列属于一个基因对应一个全长protein)，
选择.fasta格式进行下载（有时候注释时也需要将其.txt格式的文件一起下载）
2）进入MASCOT网页，导入数据库http://a4/mascot
在 Configuration editor进入，选database maintence, 进入建库操作面板，修改：
（1）选上Active, AA(氨基酸)，mem lock(把数据放入内存进行搜库)；
（2）将路径C:/MASCOT/sequence/Mouse/GRCm38.fa输入指定框，并修改为：C:/MASCOT/sequence/Mouse/GRCm38*.fa
（3）只保留parse accession 和 parse description 这两项，并且parse accession选4th项，parse description 选5th项，后面的空格全清空，再点击test definition 看格式是否喜欢，最后确定正确不报错时点击Apply 使用。
（4）然后在MASCOT网页database status（http:/a4/mascot/x-cgi/ms-status.exe）上疯狂F5刷新，观察status达到 In use(在刷新时，索引fasta文件会慢慢进入MASCOT，需要稍等)

Daemon的搜库前工作

1.先导入/IBS/文件夹已有的参数设置：D:\Program\Proteome\MASCOT_v2.3\IBS ,再保存为tmp.par，再在Task Editor导入，保存在/IBS/parameter/。
2.导入馏分，理论上每个馏分都单独进行搜库；
PS: 馏分输入下面有一个选项，[Merge MS/MS]，这一项适用于多个馏分对应一个样本的情况，才可以merge

在MASCOT建库成功后，重启Daemon 可见新库已建入，run即可；
搜库完成后，结果放在：MASCOT/data/.dat，均可用Scaffold进一步整合分析，也可用高级版的MASCOT查看其他相关信息；
PS: 1. 理论上1个mgf文件对应1个dat文件，均可在Daemon的进程列表上查询；
2.基本上按照输入顺序搜库，序号为输出的终止时间。

Scaffold整合文件及分析

官网下载Install_Scaffold_Q+S_5.2.0_Windows_x64或4.0版本，安装后导数据。

将MASCOT/data/.dat的搜库结果，先按组别名字划分好文件夹，按组顺序分别导入，如三次重复组：A,B,C仨组（x 21个馏分）分别进入；
导入时若报错memory不足，可在【Edit】中的【Preference】中，设置【Memory】为16G（16000MB）；
统计分析：进入【Quant】中【Update Experimental Design】，设置：

设【Analysis Type】为Ratio-based;
设【Experiment Type】为Between-subjects(Independent Groups);
设【Edit Sample Names and Categories】设置组数以及对应的组别颜色；
设【Organize Quant Samples】中，将每组对应的馏分拖进改组，设置【Reference】为control 组的馏分，Finish 后 Update Samples；

3e9762b407ecb2a85d746c5b2d5bade.jpg

保存为.sf3文件，方便后续导入；
导出数据前，可设置:
1)【hide decoys】去掉decoys;

Min peptides=2 或FDR threshold=1%;
Protein Threshold=99% , Peptides Threshold=95%(若蛋白过少，可放松俩阈值到90%);
4)选择【Quant】中【Launch Q+ Quantitation Module】模块，进行需要一段时间，选择【Display Options】为Fold Change Ratio，然后右键选择【Copy All Data】，黏贴到新的Excel表格去。