近日，中国农业大学玉米生物育种全国重点实验室董朝斌教授为第一及共同通讯作者，美国加州大学伯克利分校George Chuck研究员为共同通讯作者，在国际遗传学Top期刊《Nature Genetics》发表了题为“A regulatory network controlling developmental boundaries and meristem fates contributed to maize domestication”的研究论文。该研究鉴定出新的玉米驯化关键基因tasselsheath4（tsh4），并揭示tsh4位于传统玉米株型穗型驯化调控网络上游，阐明了驯化过程中玉米不同发育时期、不同性状的分子调控机理，为进一步开展玉米株型和穗型的遗传改良提供重要理论指导。
标题：A regulatory network controlling developmental boundaries and meristem fates
contributed to maize domestication（发育边界和分生组织命运的调控网络促进玉米驯化）
发表时间：2024.10.16
发表期刊：NatureGenetics
影响因子：IF29/Q1
技术平台：ChIP-seq、GWAS、RNA-seq、miRNA-seq等（易基因金牌技术）
作者单位：中国农业大学董朝斌教授、美国加州大学伯克利分校George Chuck研究员、中国农业大学博士生胡高远、美国北卡州立大学陈秋月博士、美国加州大学伯克利分校Elena Shemyakina博士等。
DOI：10.1038/s41588-024-01943-z
在早期的驯化过程中，农民精心选育多种不同的营养和生殖生长性状的玉米，但由于这些性状存在异位显性（epistasis）和功能冗余性，因此其致病位点的鉴定一直未完全确定。本研究通过染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）和全基因组关联分析（GWAS）的整合研究，鉴定出关键发育调控因子tasselsheath4（tsh4），参与调控营养生长和花序发育两阶段性状，且处于多个已知驯化位点的上游。TSH4作为新的玉米驯化因子，尽管其并不在分生组织中表达，但参与建立发育边界并决定分生组织命运。具体而言，TSH4通过双重负反馈机制发挥作用，该机制靶向抑制对其负调控的miRNA（microRNAs）。此外，TSH4与其同源基因存在功能冗余性，协同正调控一系列驯化相关位点，同时决定使现代玉米产量翻倍的分生组织。总之，TSH4在增产方面起关键作用，并助力形成理想的作物株型，从而成为驯化过程中的重要靶点。
研究方法
植物材料与生长条件：使用tsh4-mum1、ub2-mum1 和ub3-mum1 突变体植株，通过回交和自交方法将这些突变体引入B73背景中。利用近等基因系（NILs）来比较研究玉米和野生玉米（teosinte）的tsh4等位基因。
全基因组关联分析（GWAS）：利用866个玉米–野生玉米BC2S3重组自交系（RILs）和1257个BC1S4 RILs（TeoNAM群体），对多个驯化性状进行QTL-mapping，确定tsh4为候选基因。
染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）：通过TSH4抗体对3-5mm的B73幼穗原基进行染色质免疫沉淀，鉴定TSH4的下游靶基因。
转录组分析（RNA-seq）：对B73、tsh4、ub2/ub3和三重突变体的幼穗组织进行转录组测序，鉴定差异表达基因（DEGs）。
基因表达定量（RT-qPCR）：通过RT-qPCR验证ChIP-seq和RNA-seq结果，分析tsh4及其靶基因的表达水平。
免疫定位（Immunolocalization）：利用TSH4、UB2/UB3和TB1抗体对驯化玉米和野生玉米的幼穗和分生组织进行免疫定位分析。
miRNA-seq：分析tsh4、ub2/ub3双突变体和三重突变体中的miRNA表达水平，鉴定TSH4靶向的miRNA。
基因多样性分析（Diversity Scans）：对驯化玉米、地方品种玉米和野生玉米的tsh4基因进行核苷酸多样性分析。
结果图形
（1）驯化性状的全基因组关联分析
研究者对866个玉米–野生玉米BC2S3重组自交系和1,257个BC1S4 RILs（TeoNAM群体）进行了16个驯化性状的QTL-mapping。分析结果显示，多个与驯化相关的性状（如分蘖数、雄花序分支数、籽粒重量等）的QTL均定位到tsh4基因所在区间，表明tsh4是调控这些驯化性状的关键候选基因（图1a）。通过比较驯化玉米和野生玉米的tsh4等位基因，发现驯化玉米等位基因在减少分蘖数、雄花序分支数和提高籽粒重量方面具有显著效果（图1b-e）。这些结果表明，tsh4在玉米驯化过程中起到了重要作用。
（2）tsh4与ub2和ub3的功能冗余
研究发现，tsh4与其同源基因ub2和ub3在功能上存在冗余。通过分析ub2/ub3/tsh4三重突变体的雄花序和果穗，发现三重突变体表现出更严重的表型，包括雄花序分支缺失、小花序对缺失以及分蘖数增加（图1f-i）。这些表型在单突变体或双突变体中并未出现，表明tsh4、ub2和ub3在调控玉米发育过程中具有协同作用。
（3）TSH4的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）
为鉴定TSH4的下游靶基因，研究者对3-5mm的B73幼穗原基进行了ChIP-seq分析。两个生物学重复共鉴定出2,609和3,136个高置信度的结合peaks，其中1,894个peaks在两个重复中均被检测到（图2a）。这些结合peaks大多位于基因区域（80.2%），且富集在GTAC核心结合位点（图2b-c）。通过与RNA-seq数据结合，研究者发现TSH4结合的基因中有263个在tsh4突变体中差异表达，这些基因主要参与转录调控、植物激素响应和发育过程（图2e）。
（4）TSH4靶向生长素响应调控因子
研究发现，TSH4能够结合并激活多个生长素响应基因家族成员，如Aux/IAA基因。这些基因在生长素信号中起负调控作用，其表达在tsh4、ub2/ub3双突变体和三重突变体中显著下调（图3c）。通过在三重突变体中引入生长素响应报告基因（DR5rev::mRFPer）和生长素转运报告基因（pZmPIN1a::ZmPIN1a-YFP），研究者发现三重突变体中生长素响应和转运主要发生在去抑制苞叶中，而野生型中则主要发生在分生组织中（图3d-e）。这表明TSH4通过调控生长素响应基因，影响苞叶和分生组织的发育。
（5）TSH4靶向其自身的负调控miRNAs
研究发现，TSH4能够结合并抑制多个miRNA基因，包括MIR156和MIR529，这些miRNA能够降解tsh4 mRNA（图4a-b）。通过miRNA-seq分析，研究者发现这些miRNA在tsh4、ub2/ub3双突变体和三重突变体中表达上调（图4c）。通过同时进行miRNA原位杂交和TSH4免疫定位，研究者发现TSH4和MIR529在发育过程中逐渐建立互斥表达域，从而在分生组织和苞叶之间形成清晰的边界（图4e-g）。这种双重负反馈机制可能是TSH4调控发育边界的关键机制。
（6）TSH4靶向驯化位点
研究发现，TSH4能够结合并激活多个已知关键驯化基因，如tb1、tru1和tga1（图5a-c）。这些基因在玉米驯化过程中起到了关键作用，例如tb1调控分蘖抑制，tru1调控侧枝性别决定，tga1调控颖壳硬度。通过比较驯化玉米和野生玉米的tsh4等位基因，研究者发现驯化玉米等位基因在激活这些驯化基因方面更为高效（图5e）。这表明tsh4在玉米驯化过程中通过调控多个关键基因，促进了理想植物形态形成。
（7）驯化玉米与野生玉米tsh4等位基因的活性差异
研究发现，驯化玉米tsh4等位基因在表达水平上高于野生玉米等位基因，且在激活驯化基因方面更为高效（图5d-e）。通过对15个野生玉米品系和25个驯化玉米NAM群体的核苷酸多样性分析，研究者发现tsh4基因在玉米驯化过程中受到强烈的正选择（图5f-g）。这些结果表明，高表达的玉米tsh4等位基因可能是玉米驯化过程中获得理想植物形态的关键因子。
结论和启示
本研究通过结合ChIP-seq、GWAS、RNA-seq和miRNA-seq等多种技术手段，揭示了tsh4在玉米驯化过程中的关键作用。tsh4通过调控多个驯化基因和miRNA，建立了发育边界，决定了分生组织命运，并显著提高了玉米产量。
ChIP-seq技术在本研究中发挥了重要作用，通过鉴定TSH4的下游靶基因，揭示了tsh4在调控玉米发育和驯化过程中的分子机制。未来类似研究可以利用ChIP-seq技术，结合其他组学技术，深入解析植物驯化和发育过程中的复杂调控网络，为作物改良提供新的理论依据。
参考文献：
DongZ, Hu G, Chen Q, Shemyakina EA, Chau G, Whipple CJ, Fletcher JC, Chuck G. Aregulatory network controlling developmental boundaries and meristem fatescontributed to maize domestication. Nat Genet. 2024 Oct 16. doi:10.1038/s41588-024-01943-z.
