Alveolar progenitor and stem cells in lung development, renewal and cancer (review)
Abstract:
Alveoli are gas-exchange sacs lined by squamous alveolar type (AT) 1 cells and cuboidal, surfactant-secreting AT2 cells.Classical studies suggested that AT1 arise from AT2 cells, but recent studies propose other sources. Here we use molecular markers, lineage tracing and clonal analysis to map alveolar progenitors throughout the mouse lifespan. We show that, during development, AT1 andAT2 cells arise directly froma bipotent progenitor, whereas after birth new AT1 cells derive from rare, self-renewing, long-lived, mature AT2 cells that produce slowly expanding clonal foci of alveolar renewal. This stem-cell function is broadly activated by AT1 injury, and AT2 self-renewal is selectively induced by EGFR (epidermal growth factor receptor) ligands in vitro and oncogenic Kras(G12D) in vivo, efficiently generating multifocal, clonal adenomas. Thus, there is a switch after birth, when AT2 cells function as stem cells that contribute to alveolar renewal, repair and cancer. We propose that local signals regulate AT2 stem-cell activity: a signal transduced by EGFR-KRAS controls self-renewal and is hijacked during oncogenesis, whereas another signal controls reprogramming to AT1 fate.
肺泡是由AT1和AT2细胞构成的气体交换的组织囊状结构。AT1是呈鳞片状上皮细胞，AT2细胞是具有分泌表面活性物质功能的柱状上皮细胞。传统的观点认为 AT1细胞源于AT2细胞。但最新的研究提出了新的观点。该研究采用了分子标记，细胞谱系追踪，克隆分析的方法来绘制小鼠一生中肺泡祖细胞的图谱。结果表明，在发育阶段，AT1和AT2细胞均直接来源于双向潜能的祖细胞。而在出生后，新生的AT1细胞来自于罕见的、自我更新的、长寿的、成熟的AT2细胞，这些AT2细胞能够产生缓慢扩大的肺泡自我更新的灶点。AT1损伤能够广泛激活这种AT2细胞的干细胞功能。此外，体外EGFR(表皮生长因子受体)配体和体内致癌因子Kras(G12D)选择性诱导能够自我更新的AT2细胞，有效地产生多灶性的腺瘤。因此，AT2细胞作为参与肺泡更新、修复和癌变的干细胞，其功能在出生后就会发生重大转变。该研究提出，局部信号能调控AT2干细胞活性:一个EGFR-KRAS转导的信号控制AT2细胞的自我更新并在肿瘤发生过程中被劫持，而另一个信号控制AT1命运的重新编程。
AT1和AT2细胞产生于双向潜能祖细胞
成熟的AT1和AT2细胞在出生前1天左右出现，此时远端小管开始扩张（囊状化）。该研究选取了15个已知的AT1和AT2的分子标记分析气道中远端(祖细胞)和近端(at1和at2细胞)位置标记在肺囊状化过程中的转变，来推断肺泡上皮细胞分化过程中分子标记动态表达的变化过程。结果发现有表达了AT1和AT2标记的双向潜能的祖细胞在分化的早期(E)或晚期(L)关闭表达某种类型的的细胞类型标记物，在细胞成熟的后期(L)开启特定细胞类型特异性标记物(A1L、A2L)，从而产生AT1或AT2细胞。
此外还有三方面的证据支持双向潜能祖细胞模型：
（1）细胞克隆分析表明局部肺泡谱系簇具有明显的AT1和AT2细胞标记。
（2）亚显微结构分析发现明显的三类远端肺泡上皮细胞：有糖原液泡但无板层体的立方细胞(双能祖细胞)，有液泡和板层体的立方细胞(早期at2细胞)，有液泡的部分扁平细胞(早期AT1细胞)。
（3）细胞谱系追踪分析表明，利用溶菌酶(Lyz2)位点的Cre重组酶敲入(LysM-Cre)新分化的AT2细胞，在后期只有AT2细胞被标记上而AT1细胞没有被标记上。
在肺囊状化的过程及其之后的几周内，几乎没有检测到上皮细胞的增殖。这表明在发育期双向潜能祖细胞产生了绝大多数甚至全部的AT1和AT2细胞。
少量AT2细胞激活的肺泡自我更新灶点
经典的放射自显影研究表明，肺泡上皮是一种通过弥漫性增殖(可能是AT2细胞)维持的缓慢更新的细胞群。该研究使用了两个标记进行体内细胞谱系追踪以研究AT2细胞维持的作用，SftpC–Cre–ER（祖细胞和AT2中均表达）和LysM–Cre（仅在成熟的AT2中表达）。在标记后2个月(SftpC–Cre–ER)或出生后2个月(LysM–Cre)，两种细胞系在整个肺内均有明显标记的AT2细胞，显示散在的at1细胞标记有AT2谱系标记。AT2细胞对细支气管谱系的细胞包括Clara、纤毛细胞和神经内分泌细胞的维持作用不显著。
为了研究AT2细胞更新AT1的频率和空间定位，使用LysM-Cre对上述肺进行标记，并对1、2、4、8和16个月大的肺进行分析。AT1细胞在1个月时表达AT2谱系标记不足1%，4个月时表达3.9%，16个月时表达7.5%。AT1细胞的更新主要发生在毗邻小动脉的肺泡和肺周围。当新的AT1细胞出现时，肺泡基本上被替换为一半或全部，这表明肺泡只包含一两个AT1细胞。随着年龄的增长，相邻的肺泡单位也会更新，这可以通过使用AT2谱系标记的AT1细胞群缓慢扩大来证明。这些更新的AT1区域除了携带有AT2的标记，与其他区域无差别。结果表明AT1被AT2细胞更新是间歇性的，并且在空间上呈斑片状分布，随着时间的推移，“更新灶”逐渐扩大，血管周围和周围区域作为相对的“热点”。
更新灶来自单个分化的AT2细胞
每个更新灶可以来自单个AT2细胞，在这种情况下，这些细胞可能是单细胞克隆而来的或者来自多个AT2细胞。为了区分这些可能性，使用了一个依赖于CRE的多彩的报告基因（CFP），该基因随机地在每个经历重组的细胞中表达四种荧光蛋白中的一种。通过分析膜CFP谱系标记，发现更新灶的大小和渐进性扩大与使用单色报告器观察到的相似，这表明更新灶起源于单一的AT2细胞。由于lysmc - cre 的CFP重组效率较低(在16个月内2%的AT2细胞表达膜靶向CFP谱系标记)，我们能够在更新灶内识别标记的AT2细胞。大多数更新灶内含有一个或两个AT2细胞和多个AT1细胞子代分布于六个相邻的肺泡中。我们还观察到只有AT2细胞组成的小克隆灶，表明它们能够在不形成AT1细胞(自复制)的情况下进行分裂。初始的AT2细胞表达成熟AT2标记物，包括LAMP-1，一种溶酶体相关蛋白，表明它们能够产生表面活性剂。以上结果表明，每个更新灶都来自一个可以生成多个AT1或AT2的自更新AT2细胞。
急性AT1细胞损伤激活AT2细胞
氧张力升高对AT1细胞有毒性，但对AT2细胞没有毒性。2个月大的老鼠携带AT2谱系标记，暴露在氧含量达到88%环境中120小时，这使更新的AT1细胞数量增加了两倍。这一发现表明，AT2细胞在高氧损伤后会被激活，这支持了一种观点：即尽管正常情况下只有极少数AT2细胞执行干细胞功能，但也可以招募其他细胞来修复肺泡损伤。
致癌的Kras信号选择性地激活AT2自我更新
腺癌是肺癌的主要形式，其发生与Kras或Egfr突变的激活有关。腺癌通常位于肺周围区域，几乎所有的肿瘤细胞都表达SftpC，这导致长期以来人们猜测它们起源于AT2细胞或其祖细胞。通过基因敲入手段用致癌的Kras (G12D)突变替换野生型小鼠的Kras位点，肿瘤结节在整个肺内迅速生长，诱导后1个月几乎整个肺泡区域被置换，随后不久即死亡。最大的肿瘤发生在血管周围和肺周围区域，这些区域与AT2细胞的更新灶基本一致。SftpC–Cre–ER激活成年小鼠的Kras(G12D)可产生类似的结果。但是，CCSP–Cre–ER和ROSA–Cre–ER的诱导则影响较小。由腺瘤组成的转化AT2细胞继续表达AT2标记物(Nkx2.1, SftpD)，没有表达Clara标记物(CCSP)或AT1标记物(极少)。因此，致癌的Kras(G12D)似乎可以选择性地永久诱导AT2的自我更新，而不需要将细胞去编程为双能祖细胞，也不需要重新编程为AT1或Clara细胞的命运。
EGFR的活性控制AT2在培养中的自我更新
双向潜能祖细胞和AT2细胞的转录组分析表明它们都表达Egfr，和两个EGFR成员Erbb2和Erbb3。纯化后的AT2细胞具有强劲的增殖能力和AT1细胞的分化能力。此外纯化的EGF配体促进AT2的增殖，而封闭EGFR的抗体抑制AT2的增殖。
