空间visium基础全流程分析梳理

作者，Evil Genius

我们2026年空间转录组系列课程已经过去了大半，我非常感谢学员的信任,大家几乎都只有网上的交流，没有见过面，我也没有很强的背书，这种前提下还能选择参加培训，这份信任非常值得珍惜。

每个公司都有一些牛人，华大、诺禾、兰卫、欧易等等，都有，但是真正下场给大家分析项目的，基本都是我这样的人，没有什么很好的学历，有的只是工作了以后不断总结经验，天天看文献总结的分析内容；公司清华北大的博士会下场做分析么？不会，他们有更上一层的研发任务，像华大的尹烨等。

这一篇来梳理一下visium低精度的全流程。

一、分析目录

二、空间转录组基础分析

基础信息

对空间转录组的基础信息分析包括一下几个方面：

• 图像校准 ：针对图像覆盖到的区域进行数据分析，去除其他背景区域。
• Number of Genes：每个spot检测到的基因数
• Number of Counts ： 每个Spot捕获到的UMI数量

• Percentage of Mitochondrial Counts：线粒体占比（表征线粒体基因的空间分布）

  
  

空间转录组的信息总结如下：

（1）基因数：基因数量的空间分布特点

（2）线粒体基因的比例：线粒体基因比例的空间区域分布。

（3）特定的细胞污染，组织透化过程中的RNA游离污染。

三、空间转录组数据的降维聚类

与单细胞数据分析一致，需要对空转数据进行一定的数据处理，包括：Normalize（消除测序深度差异）、识别高变基因（highvariablegene,HVG,空转数据同样具有高稀疏性的特点，0值占了绝大部分，噪音较高，所以选择高度可变的有效基因进入下游分析是必要的）、不相关因素的消除（包括UMI数量差异、线粒体比例差异等因素）、数据标准化处理、降维聚类。

不同于单细胞数据分析，空间将为聚类的目的在于识别不同的空间区域，不同空间区域之间具有其独有的生物学意义和功能，目前主流的降维可视化包括tSNE和UMAP，聚类方法是leiden 和louvain，通常会将聚类的结果直接进行空间展示。

四、多样本整合及批次去除

空间数据由于技术、平台、实验人员等等原因，不同样本之间存在批次效应，空间转录组数据分析也面临多样本批次去除的问题。

批次效应对于空间数据的影响主要是基因表达的变化对定量的影响。其次就是导致本该聚类在一起的spot因为批次效应被分为不同的cluster，影响了不同空间样本整合聚类，以及下游的空间区域识别等后续分析。理想的处理结果，即相同区域仍然聚在一起，不同区域批次分开，目前主流的去批次的分析方法包括CCA和Harmony，去批次本质上就是确定不同空间样本之间的空间区域联系，如下图：

不同样本的聚类比例分布图

五、空转数据的差异分析

空转数据进行降维聚类分析后，首先需要知道的，就是每个类群（即特定区域）基因表达的主要特征。对基因的生物学功能进行甄别，目的是找到差异基因富集到的通路，进而与生物学意义联系起来。降维、聚类、差异、富集四部分内容，组成了空转数据的基础分析内容。

其中需要注意的是pct.1和pct.2，默认寻找所有clusters的差异基因，pct.1就代表了基因在该cluster 表达的百分比，而pct.2表示剩余spot表达该基因的百分比，结合显著性和avg_log2FC, 可以对基因在clusters 中的特异性有一个基础的判断。

针对得到的差异基因，也可以进行一定的空间可视化操作。

六、空转数据的富集分析

对差异基因的功能富集分析可以得知空间区域的主要生物学功能，这对于我们认知空间组织结构有十分重要的意义，借助软件clusterprofiler可以实现对差异基因的功能富集分析。

GSEA富集分析

GSVA富集分析

七、空间区域注释

同单细胞数据分析一致，空间转录组完成将为聚类之后需要对空间不同区域进行形态学识别，依据空间组织的有序性，特定的区域形成特定的组织结构，可以对空间的组织形态进行人为的划分，如下图：

同时可以参考空间数据聚类分析的结果进行空间区域的划分，聚类将表达相近的spot划分为一个cluster，原则上代表了相近功能区域的聚集，如下图：

对关键基因的可视化展示也是分析中重要的一部分。

八、单细胞空间联合分析

鉴于空间转录组学方法还不能在组织中产生深层单细胞分辨率的转录组图谱，能够成功整合单细胞和空间转录组数据的分析将有助于理解细胞类型分布的结构以及构成这种结构的细胞间通讯的机制。整合scRNA-seq 和空间转录组数据有两种主要方法：去卷积（Deconvolution）和映射（Mapping）。去卷积旨在根据单细胞数据，从每个捕获点的mRNA转录物的混合物中分离出离散的细胞亚群；映射有两方面：将指定的基于scRNA的细胞亚型定位到HPRI图谱上的每个细胞和将每个scRNA-seq细胞定位到组织的特定生态位或区域。

8.1 单细胞空间联合分析之Seurat

Seurat 做单细胞空间联合分析是目前引用最多的方法，其原理是以单细胞分辨率创建空间分辨率的细胞类型映射。绘制空间细胞图谱的第一步是基于scRNA-seq数据建立细胞类型。然后，映射的主要工作是将基于scRNA-seq的细胞类型将空间数据的每个spot分配到具体的细胞类型，分析结果如下：

8.2 单细胞空间联合分析之cell2location

Cell2location 采用分层贝叶斯框架，假设基因表达计数遵循负二项分布。 它首先使用外部 scRNAseq 数据作为参考来估计细胞类型特异性特征。 观察到的空间表达计数矩阵用负二项分布建模，其中基因可用的特定技术敏感性、基因和位置特定的加性偏移作为平均参数的一部分包括在内。 然后 cell2location 使用变分贝叶斯推理来近似后验分布并相应地产生参数估计 。

8.3 单细胞空间联合分析之RCTD

RCTD 最初是为 Slide-seq 数据设计的，但它也可以用于其他 ST 数据。 它假设观察到的每个spot的spot-level 基因计数遵循泊松分布，同时通过包含基因特异性随机效应项来解释平台效应。 RCTD 首先使用外部 scRNA-seq 参考数据来估计每种细胞类型的平均基因表达谱。 然后通过选择跨细胞类型的差异表达 (DE) 基因来执行基因过滤，并估计基因特异性平台效应的方差。将推断的平台效应插入概率模型以获得细胞类型比例的最大似然估计 (MLE)。

8.4 单细胞空间联合分析之SpotLight

SpotLight 能够对包含细胞混合物的每个捕获位置中存在的细胞类型（SPOT）和细胞类型比例进行解卷积，原理示意图如下：

通过解卷积的方法，得到每个spot含有的细胞类型比例。

8.5 空间细胞类型的可视化

对单细胞空间联合分析的结果进行可视化操作是必不可少的一部分。

8.6 单细胞空间联合分析之MIA

依据超几何富集分析的原理判断空间区域富集到的细胞类型，原理示意图如下：

分析结果体现了各个空间区域的细胞类型富集的结果

九、空间细胞聚类

对于单细胞和空间转录组的数据分析而言，聚类分析都是绕不开的一个话题，从单细胞数据分析的角度看，聚类分析得到的聚类结果，每个群代表了某种细胞类型，运用经典的marker 或者生信的手段可以将其注释并用于下游的个性化分析，单细胞所有的个性化分析都建立在细胞注释的前提之上；那么对于空间转录组，由于其每个spot包含了多个细胞，可能是相同的细胞类型，但更多的为不同细胞类型的混合，这样的条件下，空间转录组具有两种聚类的方法: 空间分子聚类和空间细胞聚类。

9.1 空间分子聚类

所谓分子聚类，即跟单细胞聚类的方法一致，采用细胞/基因的矩阵进行降维聚类，跟单细胞所不同的是这里是spot/基因的矩阵进行降维聚类，示意图如下：

对于空间转录组而言，聚类结果则代表了某个区域，但是请注意，每个区域都是由多种细胞类型混合而成，正是由于细胞类型的有序结合和相互作用，才会形成特定的空间区域，行使特定的生物学功能。

分子聚类的基础仍然是基因，从基因的角度进行聚类，也体现了基因的空间区域分布特征，而基因的载体是细胞，基因的空间区域分布，体现的就是细胞的空间特异性，尤其在细胞通讯的研究中，配受体基因的空间分布蕴含了丰富的交流信息；其次空间聚类不仅仅划分了区域特征，同时也为我们确定了组织区域的边界，组织作为一个有序的统一体，各个空间区域的边界分析、尤其是tumor与normal的边界分析，已经成为了空间转录组研究的重点。

9.2 空间细胞聚类

针对单细胞空间联合分析的结果，得到空间转录组每个spot的细胞类型的比例矩阵，针对这个矩阵，就可以另辟蹊径，结合分子聚类的分析方法，对细胞类型进行空间聚类，示意图如下：

空间细胞聚类的基础是细胞，如果spot在此基础上聚成了一类，那么这一类所含有的细胞类型及比例相近，这样的聚类结果就组成了空间分析重要的组成部分，尤其在多样本整合聚类的情况下， 采用这样的聚类方法代表了不同样本间共享的潜在细胞结构。

十、空间通讯分析

越来越多的证据表明，细胞之间的相互作用更多存在于邻域之间，在组织空间上就体现在两种或多种细胞类型出现在临近的位置，而空间通讯的方向性也成为了研究的热点。

在研究空间通讯的问题上，需要对细胞互作实施空间距离约束，以避免连接空间上相距较远的细胞类型。

十一、空间拷贝数分析（CNV）及进化树

利用空间转录组的基因表达信息推断肿瘤发生的CNV事件和空间位置，了解哪些区域的细胞产生了癌症特征可以提高对肿瘤如何生长和发展的理解，包括其在遗传上如何随着时间的推移发生变化。

空间CNV分布与进化树

十二、空间共定位分析

空间共定位分析旨在分析细胞类型的空间临近状态，而空间临近状态会随着病理条件产生变化，这种组织有序性的破坏一方面使得正常生物学功能发生了紊乱，另一方面不同细胞类型的共定位状态对疾病的预后效果会产生影响。

对空间共定位的识别有赖于对空间邻域的定义，如下图：

通常将一个spot的临近6个spot定义为邻域，出现在邻域的细胞则组成了生态位，也就是细胞类型存在空间共定位的情况。

在细胞类型共定位的基础上，细胞之间的互作通常发生在细胞邻域，也就是配受体的表达通常也会体现出共定位的现象。

十三、空间细胞网络分析

细胞在空间位置上不是随机出现的，细胞在空间上的定位受到了周围环境以及自身状态的影响，而这种影响的结果，就是每种细胞类型在空间上形成了具有区域偏好性的细胞“网络”，同型细胞“网络”是为了确定单一细胞类型在空间上的分布特点，多条件进行比较会发现明显的差异和生物学变化。

同型细胞“网络”是为了确定单一细胞类型在空间上的分布特点，但为了确定不同细胞类别之间的空间关系，称之为异型细胞“网络”，即不同细胞类型空间上的连通性，用来衡量不同细胞类型之间的空间临近关系，现在研究表明，不同细胞类型在空间上的连通性与疾病的预后相关。

十四、空间轨迹

不同于单细胞数据分析，空间轨迹研究的内容主要是随着组织部位的不同，基因或细胞的丰度变化，示意图如下：

即空间轨迹描绘是的在空间方向上的基因/细胞的丰度变化

十五、空间WGCNA分析

加权基因共表达网络分析 (WGCNA,Weightedcorrelationnetworkanalysis)是用来描述不同样品之间基因关联模式的系统生物学方法，用来鉴定高度协同变化的基因集,并根据基因集的内连性和基因集与表型之间的关联鉴定候补生物标记基因或治疗靶点。

模块分析

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