背景介绍
红大戟（Knoxia valerianoides）为茜草科植物，是我国重要的中药材。具有清热解毒、抗炎、抗肿瘤等药理作用，在临床上广泛用于治疗炎症、癌症及感染性疾病。其根部的活性成分以蒽醌类和三萜类化合物为主，具有重要药用价值。近年来，随着市场需求增加，红大戟的大规模种植不断扩展，但现象普遍存在，导致土壤理化性质退化、微生物群落失衡，进而引起产量下降、品质降低，根腐病等土传病害高发，已成为制约其人工种植可持续发展的关键因素。
连作障碍是指同一地块连续多年种植同种作物后，植株生长减弱、病虫害加重、产量品质下降的现象。其主要成因包括：土壤理化性质恶化（pH变化、养分失衡）、自毒物质积累（酚酸类等化感物质）、根际微生物群落失衡（有益微生物减少、病原微生物富集）。在丹参、三七、黄连等药用植物中均有报道，连作会导致土壤微生物区系从健康向病害转变，进而诱发根腐病等土传病害。
近年来，高通量测序技术（如Illumina MiSeq）为解析微生物群落提供了有力工具，具有通量高、无需培养、覆盖全面等优势，已广泛应用于土壤、根际及植物内生真菌的研究。根际与内生真菌在植物营养吸收、病原抑制及免疫调节中发挥重要作用，其群落失衡被认为是根腐病发生的重要原因。
目前，红大戟根际与内生真菌在连作条件下的变化机制还缺乏研究。本研究采用高通量测序技术，系统对比不同连作年限及根腐病状态下，根际与根部内生真菌的多样性、群落结构及其与土壤理化性质的关系，为阐明根腐病发病机制及连作障碍治理提供科学依据。
iplant链接：https://www.iplant.cn/info/Knoxia%20valerianoides?t=z
研究进展（研究现状）
1、“Tan Y et al., 2017”采用Illumina MiSeq高通量测序技术，对连作条件下三七的根际与根部内生真菌群落进行了系统研究。结果表明，连作导致根际土壤与根部内生真菌多样性升高，子囊菌门、接合菌门、担子菌门和壶菌门为主要优势菌门。根腐病感病植株根际与根部的真菌多样性低于同一年份健康植株，表明根腐病对真菌群落结构与多样性产生显著影响。
2、“Alami MM et al., 2020”通过高通量测序技术研究了连作对黄连根际土壤真菌群落结构、功能、多样性和组成的影响。研究检测到子囊菌门、担子菌门、壶菌门、球囊菌门和被孢霉门五大真菌门类，其中子囊菌门为优势菌门。分析显示连作5年的黄连田中真菌多样性高于荒田。同时揭示了土壤理化性质与真菌群落结构之间的关系，为缓解黄连连作障碍提供了重要参考。
3、“Bao L et al., 2022”基于UPLC-MS/MS和Illumina MiSeq高通量测序技术，探究了三七连作根际土壤中酚酸类自毒物质与微生物之间的相互作用。研究发现，连作显著改变了微生物群落结构，增加了细菌多样性但降低了真菌多样性。外源酚酸（p-HA和VA）可促进病原菌（包括镰刀菌属和Ilyonectria）的生长，是连作条件下三七的主要酚酸类自毒物质。土壤速效钾、全氮、有机质和水解性氮与土壤微生物群落的关联最为显著。该研究表明酚酸与根际微生物的互作是干扰三七根际微生态的主要原因。
4、“Li M et al., 2020”该研究比较分析了不同产量三七的根际微生物群落组成与功能。研究发现根际微生物群落结构与三七产量密切相关，连作导致根际有益微生物减少、病原菌累积是三七产量下降的重要驱动因素。根际微生物群落的失衡是导致不同地块产量差异的重要原因。
论文核心信息
论文标题：Assessing the biodiversity of rhizosphere and endophytic fungi in Knoxia valerianoides under continuous cropping conditions（连作条件下红大戟根际与内生真菌的生物多样性评估）
作者：Chunju Liu, Lei Zhang, Heng Li, Xiahong He, Jiahong Dong, Bin Qiu
作者第一单位：云南农业大学植物保护学院
根际真菌和内生真菌在植物健康和作物生产力中起着重要作用。然而，其在连作过程中的群落动态却鲜有报道。红大戟是茜草科的多年生草本植物，长期以来一直被用作草药。本研究使用高通量测序技术Illumina MiSeq来研究红大戟根际和内生真菌的结构和功能动态。结果表明，连续种植增加了根际真菌的丰富度和多样性，但同时导致根际真菌的丰富度和多样性下降。根部内生真菌群落多样性低于根际真菌。在连作过程中，子囊菌门和担子菌门是优势菌门。此外，我们还发现根腐病直接影响根际和根部真菌群落的结构和多样性。因此，根腐病植株的根际和内生真菌群落都比健康植株表现出更高的丰富度。2年生和3年生根腐病植株中镰刀菌的相对丰度显著高于对照，表明连续种植对红大戟的健康产生了负面影响。分析表明，土壤pH、有机质(OM)、速效钾、全钾、土壤蔗糖酶(S_SC)、土壤过氧化氢酶(S_CAT)、土壤纤维素酶(S_CL)与真菌群落动态变化显著相关(p<0.05)。本研究首次报道了红大戟根际和根部真菌种类的多样性。根际土壤真菌多样性高于根际内生真菌。根腐病植株的真菌多样性高于健康植株。土壤pH、有机质、速效钾、全钾、S_CAT、S_SC和S_CL与真菌多样性显著相关。根腐病的发生对根际和根际内生真菌的群落结构和多样性产生了影响。
关键词：红大戟、连作、根际真菌、内生真菌、理化性质
链接：https://rdcu.be/fhAkn
发表杂志：BMC Microbiology
主要科学问题：
1、不同连作年限下，红大戟根际与内生真菌的多样性和群落结构如何变化？
2、根腐病对红大戟真菌群落组成有何影响？
3、土壤理化性质与酶活性如何调控真菌群落动态？
研究方法
采样设计：于云南省大理白族自治州祥云县红大戟主产区，共选取6块样地进行采集，每个样地中5个植株的根系土壤样品合为一个样品，并采集未种植区域作为对照。采集1-3年生健康植株和根际土壤、2-3年生根腐病植株和根际土壤，采样深度为0-30cm。
样品处理：根部样品经流水冲洗、无菌水清洗、70%乙浸泡4min、2%次氯酸钠洗涤1-2min，后备用；土壤样品过4mm筛去除杂质，与根部样品一同置于-80℃保存。
测序与分析：采用PowerSoil Pro DNA试剂盒提取微生物基因组DNA，以ITS基因作为靶点进行PCR扩增，通过 Illumina MiSeq PE300平台测序；原始数据经质控、OTU 聚类（97%相似度）后，进行Alpha多样性、NMDS、CCA 等统计分析。
土壤指标测定：采用玻璃电极测定pH，重铬酸钾氧化滴定法测定有机质（OM），钼蓝法测定速效磷（AP），并通过试剂盒检测土壤过氧化氢酶(S_CAT)、土壤尿素酶(S_UE)、土壤蔗糖酶(S_SC)和土壤纤维素酶(S_CL)酶活性。
创新点
首次系统揭示红大戟根际与内生真菌的多样性特征，明确根际真菌多样性显著高于根部内生真菌，填补该物种根部微生物复合体研究空白。
区分健康植物与根腐病植株双重因素，揭示根腐病对红大戟根际和根部内生真菌群落的影响。
将真菌群落动态与土壤理化性质（pH、有机质、养分）及酶活性（CAT、SC、UE、CL）多因子进行关联，明确了驱动真菌群落变化的关键环境因子。
主要结论
1. 土壤理化性质与酶活性的变化
连作显著改变了土壤性质。与未种植对照（S_CK）相比，连作土壤的pH、有机质、水解性氮、有效磷、全氮、全磷及蔗糖酶、脲酶活性均显著升高（p<0.05）。感病植株土壤的pH和过氧化氢酶活性高于健康植株，而速效钾和脲酶活性则较低（表1）。
2. 真菌群落的整体组成与α多样性：共获得3211327条高质量ITS序列，聚类为5312个OTUs。稀释曲线趋于平缓，覆盖度均高于99.31%，表明测序数据充分。
根际真菌的丰富度（Sobs、Chao、Ace）和多样性（Shannon）显著高于根部内生真菌。
随着连作年限增加，健康植株根部内生真菌的丰富度（Ace、Chao）逐渐下降；而根际真菌的丰富度反而上升。
根腐病感病植株的根际和根部内生真菌多样性均高于健康植株（R_D3 > R_H3，S_D3 > S_H3）。田间调查显示，根腐病发病率随连作年限增加而上升，与真菌多样性变化趋势一致。
3. 真菌群落结构：根际土壤和根样真菌群落结构共有16门、61纲、152目、365科、883属。
门水平：子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）为优势菌门。在R_H3和R_D3中，子囊菌门相对丰度分别高达90.86%和98.88%。
属水平：土壤和根样中部分真菌属的相对丰度在不同连作年限之间存在显著差异。对照土壤（S_CK）中优势属为 Solicoecozyma（8%），但其丰度随连作年限的升高而降低。健康3年根际土（S_H3）中 Mortierella（被孢霉属）和 Didymellaceae 为优势菌；感病土壤（S_D3）中两者丰度更高。
Fusarium（镰刀菌属）和 Gibberella 的丰度随连作年限及根腐病发生而显著增加。
根部内生真菌中，R_H3以 Phialophora（64%）为主，R_D3中 Phialophora 仍占41%；R_D2中 Exophiala 占28%。结果表明（图3B），不同样品间真菌群落组成差异显著(R=0.7925，p=0.001)，表明连作对真菌群落有显著影响。
对丰度前 35 的真菌属做层级聚类分析（图3A），连作年限显著改变土壤、根系各真菌属相对丰度。S_CK 以Solicoccozyma为主且随连作年限丰度下降；Mortierella、Didymellaceae、Chaetomiaceae、Olpidium、Phialophora、Exophiala、Issatchenkia 分别为不同连作处理土壤/根系的优势属，且同类群在不同年限样本间丰度有明显差异。
基于 abund-jaccard 距离开展NMDS分析（图3B），组间群落差异显著（R=0.7925，p=0.001），说明连作显著影响珠子参根际及根系真菌群落组成与结构。
4. 环境因子与真菌群落的相关性
研究发现，pH、全磷、全钾、全氮与纤维素酶活性（S_CL）之间存在相互关联；有机质、水解性氮、速效钾、脲酶活性（S_UE）与纤维素酶活性（S_CL）同样存在组内相关性。此外，pH、有机质（OM）、速效钾、全钾、全磷、过氧化氢酶活性（S_CAT）、蔗糖酶活性（S_SC）、纤维素酶活性（S_CL） 均与真菌群落结构呈显著相关（图 4A）。
Spearman热图（图4B）显示，油壶菌属（Olpidium） 相对丰度与脲酶活性、纤维素酶活性、速效钾、有机质、水解性氮呈显著负相关，与全钾、pH、过氧化氢酶活性呈显著正相关；指梭孢属（Dactylonectria） 相对丰度与全钾、pH、过氧化氢酶活性呈显著正相关；瓶霉属（Phialophora） 相对丰度与有机质、水解性氮、蔗糖酶活性呈显著正相关（图 4B）。
个人评述
本论文采用高通量测序技术，系统对比了不同连作年限的红大戟健康植株及根腐病感病植株其根际与内生真菌群落的差异。研究发现，连作会导致红大戟根际真菌丰富度增加，但根部内生真菌丰富度下降。根腐病感病植株的真菌多样性反而高于健康植株，这可能与病原菌入侵后条件致病菌或腐生菌的增殖有关。镰刀菌属的显著富集进一步证实了其为根腐病的重要病原菌。同时也指出土壤pH、有机质及多种酶活性是真菌群落变化的关键驱动因子。
通过学习本研究的思路与方法，对植物-微生物互作领域的研究设计有了更深入的理解。其创新之处在于同时考虑了连作年限和病害状态两种影响因子，并且将根际真菌与根际内生菌分开分析，精确的揭示了微生物群落在不同生境中的差异。此外，该研究通过CCA和相关性等分析，将真菌群落结构与土壤理化、酶活性数据关联分析，有助于进一步阐明连作条件下土壤微环境与微生物群落的互作规律，为探究红大戟连作障碍成因提供依据。该技术路线同样适用于其他药用植物的连作障碍研究，通过不同因素之间的对比分析，明确植物与土壤环境之间的关系，为缓解药用植物的连作障碍及合理种植提供理论参考。
