肌肉发育缺陷是人类先天性疾病的常见类型，常导致严重功能障碍，其核心机制与成肌细胞分化、融合的分子调控紊乱密切相关，但多数关键调控因子尚未被系统解析。佐治亚大学分子医学中心和遗传学系团队在Nature Communications发表的研究，通过创新的拆分毒素CRISPR筛选平台，系统性鉴定出250个人类成肌细胞融合必需基因，首次揭示了多通路协同调控肌生成的分子网络，并明确41个靶点与人类肌肉异常疾病直接相关。作为功能基因组学服务领域的领军者，海星生物（HySigen）的CRISPR文库筛选服务凭借定制化文库设计、高效表型筛选的技术优势，成为这类大规模靶点发现研究的核心支撑，助力科研团队快速解码基因功能与肌肉发育的关联。
一、核心研究方法
1. 定制化MyoCRISPR-KO文库设计与构建
基于7个供体成肌细胞的转录组数据，筛选出6896个肌生成各阶段均表达的基因（TPM>1），覆盖90%的肌细胞表达转录本，避免全基因组文库的筛选冗余（图2a,b）。设计的文库包含21,396条sgRNA，每个基因对应3条高特异性sgRNA（优先选择脱靶率低、敲除效率高的序列），另含900条非靶向对照sgRNA。在一个简单的成肌细胞适应性筛选中，该文库成功识别出419个对细胞存活/增殖至关重要的基因（如核糖体蛋白基因）和47个负调控细胞周期的基因（如TP53, NF2），验证了文库的有效性（图2e-h）。
图2.设计并验证针对人类成肌细胞CRISPR-KO文库
2. 创新的拆分毒素表型耦联策略
这是本研究的核心创新点。研究者将白喉毒素A片段（DTA）拆分为两半（DTAN和DTAC），并分别与细菌内含肽（intein）片段融合，构建成两个独立的无毒载体：DTAN-InteinN和InteinC-DTAC（图3a）。当分别表达这两种毒素片段的成肌细胞被共培养并发生融合时，在形成的合胞体内部，内含肽介导的蛋白质反式剪接会使DTA毒素重新组装并恢复活性，从而选择性杀死已融合的多核肌管（图3a,c）。而由于CRISPR敲除导致融合缺陷的单个成肌细胞则因无法形成合胞体而存活（图3b）。这一策略将“细胞融合”这一复杂表型，直接耦合到了易于检测和富集的“细胞存活/死亡”表型上。
图3.一种经过合理设计的表型检测策略，用于筛选出融合缺陷型的成肌细胞
3. 整合筛选流程与数据分析
筛选流程如图4a所示：将稳定表达DTAN-InteinN的成肌细胞用MyoCRISPR-KO文库进行感染和编辑，然后分为两组。“杀手组”与表达互补毒素InteinC-DTAC的成肌细胞共培养，融合细胞被杀死；“对照组”与表达相同DTAN-InteinN的细胞共培养，无活性毒素产生。通过比较两组细胞中gRNA的相对丰度变化，即可鉴定出对融合至关重要的基因（图4b）。数据分析采用MAGeCK等标准化流程。
图4.成肌细胞融合筛选的概念验证测试揭示了大量新的靶点
二、主要研究结论
结论一：概念验证筛选成功鉴定并验证了大量调控成肌细胞融合的关键因子
筛选鉴定出250个“命中基因”（FDR<0.1）。曼哈顿不仅展示了这些基因在染色体上的广泛分布，还特别高亮了14个已知的生肌调节基因，如肌肉融合蛋白Myomaker(MYMK)、核心转录因子MyoD和Myf5，以及MyoD的辅助因子TCF12、p300等。这一结果强有力地证明了该筛选平台能够有效回收已知的生物学通路，验证了其可靠性（图4c）。
为确保发现的普适性，研究者进行了多层次验证。首先构建了针对这250个基因的聚焦型CRISPR文库，并在不同解剖来源（阔筋膜张肌、股四头肌）的人类成肌细胞系以及小鼠原代成肌细胞中重复了筛选，结果显示靶向候选基因的gRNA在“杀手组”中均表现出一致的富集趋势，证明了筛选结果的稳健性与跨物种保守性（图4d-f）。
此外，研究者还进行了正交验证。他们随机挑选了125个命中基因，在不依赖拆分毒素的情况下进行个体化敲除实验。与对照相比，敲除这些基因导致单核（未融合）细胞比例显著增加，并伴有肌管形态缺陷，直接证实了这些基因在成肌细胞融合中的必需功能（图4g-h）。
结论二：命中基因形成高度互联的功能模块网络，并与人类肌肉疾病显著相关
为进一步理解250个命中基因之间的功能关系，研究者进行了系统的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析（STRING）。分析发现，160个命中基因之间存在1286个经过实验验证的相互作用，显著高于随机预期。更重要的是，这些蛋白质并非孤立运作，而是聚类形成23个不同的功能蛋白复合物（图5中以不同颜色高亮）。这些复合物覆盖了广泛的细胞过程，包括：
1.基因表达调控：如ISWI染色质重塑复合物、m6A mRNA甲基化复合物（METTL3/METTL14/WTAP）、负辅因子2复合物。
2.蛋白质稳态与修饰：如分子伴侣CCT/TCP1复合物、SUMO激活复合物、N端乙酰化复合物。
3.细胞器与运输：如HOPS复合物（内体/溶酶体运输）、动力蛋白复合物（微管运输）。
4.RNA代谢：如RNA稳定性调节因子（ILF3,DHX9）。
该网络分析首次将许多此前与肌肉发育无关的细胞基础功能模块，与成肌细胞融合这一特定生物学过程联系起来，揭示了其背后高度模块化和协调的调控网络。
为评估其临床相关性，研究者讲融合筛选结果与医学表型数据库交叉比对共发现41个突变在人类中会导致骨骼肌形态异常的人类疾病的基因（用α标记）。例如，新发现的命中基因CHAMP1，其突变已知会导致伴有肌张力低下、肌肉无力等肌肉症状的神经发育障碍，但其在肌肉中的功能此前未知。这一发现直接将基础筛选结果与临床疾病表型紧密相连，为理解这些疾病的病理机制提供了全新的候选基因和潜在通路。
图5.成肌细胞融合筛选的高功能连接性和临床相关性
结论三：单细胞多组学分析揭示融合调控因子通过影响早期肌源性分化发挥作用
为了在单细胞分辨率下探究这些融合缺陷基因的具体作用机制，研究者用携带靶向250个命中基因的gRNA文库感染细胞，经过与毒素表达细胞的共培养筛选后，对存活下来的单核细胞进行scRNA-seq，同时捕获其基因敲除身份（gRNA）和全转录组状态（图6a）。UMAP分析将细胞分为10个簇。通过分析各簇的标志基因（图6b），可以清晰区分处于增殖状态的细胞（簇#4，表达MKI67等）、分化良好的肌源性细胞（簇#1,2,5,7，高表达MYOG,MYH家族基因等）以及分化不良的细胞（其他簇）。
研究者进一步计算了“肌肉分化评分（MDS）”来量化每个细胞的肌源性分化程度（图6d-e）。
1. 敲除Myomaker（MYMK）的细胞分化评分最高，说明其融合缺陷是“纯融合”机制问题，不影响早期分化程序。
2. 敲除MyoD及其辅助复合物（TCF12,p300）的细胞分化评分最低，证实它们作为核心转录调控因子，其缺失会根本性阻断肌源性分化。
3. 敲除其他大多数复合物（如m6A甲基化复合物、染色质重塑复合物等）的细胞，其分化评分介于两者之间但显著降低，表明它们主要通过影响更广泛的早期肌源性分化程序，进而间接导致融合失败。
gRNA富集分析进一步支持了这一结论：Myomaker的gRNA富集在分化良好的细胞簇中，而MyoD、m6A复合物等的gRNA则特异性地富集在分化不良的细胞簇中（图6）。
作为机制验证的范例，研究者聚焦于在筛选中命中且单细胞数据预测影响分化的m6A甲基转移酶复合物（METTL3,METTL14,WTAP）。后续实验证实，敲除这些基因不仅导致严重的融合缺陷，还伴随肌肉分化标志物（包括MYMK本身）和细胞粘附分子表达的全面下调，完美验证了单细胞分析得出的“通过调控分化影响融合”的机制模型。
图6.成肌细胞融合筛选结果中单细胞CRISPR和转录组分析
三、总结与展望
本研究通过创新的拆分毒素CRISPR筛选平台，首次系统绘制了人类成肌细胞融合的分子调控网络，鉴定出250个必需基因和23个功能复合物，其中41个靶点直接关联人类肌肉异常疾病，为先天性肌肉发育障碍的病因诊断提供了核心资源。海星生物（HySigen）的定制化CRISPR文库筛选服务，凭借“基因聚焦+表型精准”的技术优势，完美匹配本研究的筛选需求，大幅提升了靶点发现的效率和准确性。
未来，可基于该筛选体系进一步挖掘肌肉发育不同阶段的调控因子，结合海星生物的CRISPR筛选与单细胞测序配套服务，解析靶点在肌肉再生、疾病进展中的动态功能；同时，41个疾病相关靶点为药物开发提供了明确方向，尤其m6A修饰复合物、SUMO激活复合物等新通路，有望成为肌肉发育障碍的靶向治疗突破口。该研究建立的“定制化文库+功能筛选+临床关联”范式，也为其他组织细胞表型（如细胞黏附、分化）的大规模靶点发现提供了可借鉴的技术框架。
参考文献：Zhang H, Shang R, Zhang Z, et al. Development of a split-toxin CRISPR screening platform to systematically identify regulators of human myoblast fusion[J]. Nature Communications, 2026, 17(1): 547.
https://doi.org/10.1038/s41467-025-67583-x
技术服务：CRISPR/Cas9细胞基因编辑、CRISPR文库筛选/文库病毒/载体构建、分子诊断参考品/突变基因参考品/融合基因参考品、细胞稳转 / 细胞干扰
细胞试剂：HyCyte®干细胞/原代细胞/细胞株、三系诱导培养试剂、细胞专用培养基、基因编辑试剂盒、病毒现货、预筛选胎牛血清
