Uncovering N4-Acetylcytidine-Related mRNA Modification Pattern and Landscape of Stemness and Immunity in Hepatocellular Carcinoma
揭示肝细胞癌中 N4-乙酰胞苷相关的 mRNA 修饰模式和干性和免疫景观
发表期刊：Front Cell Dev Biol
发表日期：2022 Apr 14
DOI: 10.3389/fcell.2022.861000
一、背景
在世界范围内，肝癌已经成为一个突出的公共卫生问题，发病率和死亡率都很高。各种危险因素都会导致HCC肿瘤的发生，包括酗酒、乙肝和丙肝病毒感染以及代谢性疾病。癌症干细胞（CSCs）代表了一种罕见的癌细胞亚群，表现出正常干细胞的广泛特征，如无限制的分裂、自我更新和分化。越来越多的证据表明，肿瘤的复发、转移和耐药性的发展可以用CSCs的存在来解释，导致患者的预后不佳。
新出现的证据显示，转录后的RNA修饰，也被称为表观转录组，参与了肿瘤发生、侵袭、转移甚至耐药的复杂生物学过程。N4-乙酰胞苷（ac4C）修饰是一种古老而高度保守的RNA修饰，以前曾在rRNA和tRNA中报道过，而最新研究发现，人类中N-乙酰转移酶10（NAT10）催化的ac4C修饰也可能以动态方式发生在广泛的mRNA上，促进翻译过程，增强mRNA稳定性。有研究发现，NAT10介导的COL5A1的ac4C促进了胃癌的转移
二、材料与方法
1.数据来源
1）TCGA：从UCSC Xena下载了肝癌（LIHC）、胰腺癌（PAAD）和肺腺癌（LUAD）基因表达数据、临床信息
2）ICGC：表达数据以及肝癌患者的生存信息（LIRI）
3）GEO：人类肝细胞癌微阵列基因表达数据（GSE14520）以及匹配的phenoData
4）免疫阻断治疗（抗PD1）和mTOR抑制剂治疗（抗mTOR）的透明细胞肾癌队列也被纳入本研究
5）免疫组化从人类蛋白质图谱获得
6）从已发表文章的补充表格中手动选择了ac4C修饰的基因列表：GSE102113
2.实验流程
1）识别差异表达的ac4C修饰基因：R软件limma包
2）ac4C基因特征的构建和验证：多变量Cox回归模型和LASSO与10倍交叉验证算法
3）体细胞突变分析：对LIHC和高ac4Cscore及低ac4Cscore组的ac4C-DEGs的SNVs和INDELs进行了分析；计算肿瘤突变负荷（TMB）；计算突变位点肿瘤异质性（MATH）
4）功能丰富度分析：R软件包clusterProfiler进行GO和KEGG分析；基因集富集分析（GSEA）
5）肿瘤干性的估计：Tathiane M. Malta等人开发了一种创新的一类逻辑回归（OCLR）机器学习算法来揭示肿瘤干性的特征
6）肿瘤微环境的估计：ESTIMATE算法被用来预测肿瘤的纯度以及基质和免疫细胞浸润；CIBERSORT；从免疫学数据库和分析门户网站（ImmPort）下载免疫特征列表
7）细胞培养和基因敲除、细胞增殖试验、EdU染色法、细胞凋亡检测
三、实验结果
01 - 肝癌中N-乙酰转移酶10相关的ac4C-DEGs的鉴定
从TCGA下载HCC和正常肝脏样本中的表达。与正常样本相比，NAT10在HCC中的表达异常高（图1A）。使用人类蛋白质图谱数据库也检查了NAT10的蛋白质表达，并观察到同样的趋势。在8个HCC样本中，有5个是染色阳性的，而3个正常肝脏样本中的3个都是阴性的（图1B）。对于那些被诊断为HCC的人来说，NAT10的高表达表明生存结果较短，尤其是在前5年内（图1C）。为了研究缺乏NAT10的HCC细胞的增殖情况，进行了CCK-8、菌落形成和EdU染色试验。结果显示，通过shRNAs敲除NAT10后，HepG2和Huh7的细胞生长被明显抑制（图1D，E）。还发现NAT10可能在调控细胞凋亡方面发挥了作用。这些结果表明NAT10在HCC中发挥了潜在的致癌作用。
NAT10被认为是许多分子成分的乙酰化转移酶。由NAT10介导的ac4C修饰的2156个基因中，总共有250个基因在肿瘤和正常肝组织之间表现出明显不同的表达模式。在这两个基因组中，有21个基因相交并被定义为ac4C-DEGs（图2A）。与正常样本相比，这些基因中的大多数在肿瘤中都是上调的，而只有LY6E是下调的。因此，用主成分分析可以观察到这两组的不同表达模式（图2B）。GO分析表明，ac4C-DEGs与DNA复制和细胞周期有关，而KEGG注释说这些基因参与了p53信号通路和多种肿瘤类型（补充图S2B）。体细胞突变分析显示，ac4C-DEGs几乎没有SNV或INDEL，但CNV结果显示FAM189B、LY6E、RECQL4和TK1的扩增频率，以及CDKN2A和SFN的缺失频率都大于10%（补充图S3）。然后，构建多变量Cox回归模型和LASSO算法来确定影响患者预后的关键基因，并选出COL15A1、G6PD和TP53I3（图2C）。虽然三个关键基因在肿瘤样本中明显上调（图2D），但COL15A1起到了有利因素的作用，而其他两个则作为风险因素（图2C）。K-M曲线分析进一步证实了这三个关键基因的独立预后价值（图2E-G）。最后，COL15A1、G6PD和TP53I3中，由NAT10介导的ac4C修饰的存在得到证实（图2H）。这些结果意味着ac4C相关的修饰基因可能参与了肿瘤的发生，并与患者的不同预后有关。
02 - ac4Cscore的构建和临床意义
作者利用关键基因的表达和系数，构建了一个模型，称为ac4Cscore。根据患者的ac4Cscore，将其分为高组和低组。正如预期的那样，ac4Cscore与NAT10的表达呈中等程度的正相关（图3A），高ac4Cscore组的NAT10表达明显高于低ac4Cscore组（图3B），ac4Cscore较高的人的预后明显较差（图3C）。在这两组中没有观察到年龄或性别差异（补充图S5A,B）。然而，与ac4C-低组相比，ac4C-高组有较大比例的晚期肿瘤等级（G3-4）的患者，这表明ac4Cscore在临床和病理诊断中的预测能力（图3D）。两组的T、N和M期没有明显差异（补充图S5C-E）。
作者还分析了高低ac4Cscore组之间体细胞突变特征。高ac4Cscore组明显与TP53突变的高发率有关（图3E），然而这两组的TMB和MATH分数并无明显差异（补充图S5F,G）。因此，GISTIC2被用来检测大多数不同的异常CNV区域，高ac4Cscore组比低ac4Cscore组包含的扩增和缺失区域都少（图3F,G）。对于高ac4Cscore组来说，最明显的扩增高峰落在8q24.21的细胞带。位于该区域的基因，包括MYC、POU5F1B和PVR1，其他峰值落在1q21.3和17q25.3，删除峰落在17p13.1、13q14.2和8p23.2的细胞带（图3F）。对于低ac4Cscore组，扩增峰包括6p21.1、11q13.3和17q25.3，涉及VEGFA、CD7、CSNK1D和UTS2R，删除峰还包括17p13.1、1p36.31和13q14.2（图3G）。上述结果显示两组之间体细胞突变的分布不同。
同时，测定了两个ac4Cscore组之间的差异表达基因。GSEA结果说明，高ac4Cscore组的上调基因主要富集在细胞周期和DNA复制途径中（图3H,I），提示患者的预后不良可能是由肿瘤细胞的快速增殖引起的。高ac4Cscore组中活化的核糖体途径与先前的发现一致，即mRNA的ac4C修饰可能促进翻译（图 3J），再次证实了模型的有效性。
03 - ac4Cscore与肿瘤干性有关
为了揭示ac4Cscore与肿瘤干性的内在联系，作者提取了几个干性相关基因的表达。随着患者ac4Cscore的增加，大多数标记物，如KDM5B、EZH2、CD44和POU5F1的表达也趋于升高（图4A），观察到ac4Cscore和这些基因之间存在明显的相关性。然而，有几个标志物没有表现出明显的上升，甚至有相反的趋势。考虑到单基因表达可能被肿瘤异质性和批量分析中的组织采样偏差所混淆，作者采用了一种机器学习方法，称为mRNAsi，来全面分析ac4Cscore和肿瘤干性的关联。皮尔逊相关系数结果显示，ac4Cscore和mRNAsi之间存在明显的正相关（图4B）。此外，ac4Cscore高组的mRNAsi明显高于ac4Cscore低组（图4C）。还注意到，mRNAsi和ac4Cscore的组合可以作为预测患者预后的指标，高ac4Cscore和高mRNAsi的患者预后最差，而低ac4Cscore和低mRNAsi的患者预后更好（图4D），5年内的预测能力很强。最后,进行了GSEA，结果显示各种干细胞基因组在ac4Cscore高的组别中被富集(图4E)。此外，不同的机制，包括碱基切除修复、错配修复和核苷酸切除修复途径，可以帮助CSCs在极端环境下生存，也在ac4Cscore高组中富集。这些发现揭示了ac4Cscore和肿瘤干性的关联。
04 - 不同ac4Cscore组的肿瘤微环境特征
为了定量分析不同ac4Cscore组的肿瘤微环境状况，作者同时进行了ESTIMATE和CIBERSORT算法（图5A）。与低ac4Cscore组相比，ac4Cscore高组的基质评分明显较低，而免疫评分则较高，两组之间的ESTIMATE评分和肿瘤纯度没有明显差异（补充图S7AB）。GSEA结果显示，ac4Cscore高组的主要免疫缺陷途径富集，表明该组的不良预后可能是由免疫细胞失调引起的（图5B）。进一步研究了这两组的免疫浸润的差异，浆细胞、T细胞滤泡辅助细胞、T细胞调控、巨噬细胞M0和中性粒细胞的比例在高ac4Cscore组更丰富，而T细胞记忆静息、NK细胞静息、单核细胞、巨噬细胞M2和肥大细胞静息的比例在低ac4Cscore组更充足（图5C）。为了更好地说明ac4Cscore在免疫中的作用，提取了LIHC的可用免疫亚型。亚型IFN-gamma主导型和伤口愈合型主要由ac4Cscore高组组成，而低ac4Cscore组主要由炎症型和TGF-beta主导型亚型组成（图5D）。即使亚型淋巴细胞耗竭约占每组的一半，但生存曲线显示，ac4Cscore高的患者的预后要比低组的差（补充图S7C）。接下来，进行了GSVA来研究ac4Cscore和免疫特征的相关性。高ac4Cscore组在干扰素受体以及抗原处理和表达方面的通路活性变化较高，而ac4Cscore低组的细胞因子受体和TGF-β家族成员的活性变化较高（补充图S7D）。Corrplot结果显示ac4Cscore和免疫特征之间存在正负相关关系（图5E）。上述结果表明，ac4Cscore可能对肿瘤微环境有影响，特别是免疫浸润。
05 - ac4Cscore在其他数据集的验证
为了验证ac4Cscore的实用价值，本研究中还涉及了其他四个数据集。根据之前描述的工作流程计算的ac4Cscore，每个数据集中的患者都被分为高组和低组。高ac4Cscore组患者的预后明显差于低ac4Cscore组（图6A-D）。从三个HCC交叉数据库中提取了一致的GSEA结果用于KEGG通路分析，ac4Cscore-高组显示了各种代谢途径的共同下调。值得注意的是，交叉数据集的结果证实了细胞增殖相关途径的上调，包括DNA复制、细胞周期、Hippo信号通路和p53信号通路（图6E）。然后，估计mRNAsi来代表每个病人的肿瘤干性，在其他四个数据集中，高ac4Cscore组的mRNAsi分别明显高于低ac4Cscore组（图6F）。此外，与低ac4Cscore组相比，高ac4Cscore组的平均mRNAsi更高。核苷酸切除修复、错配修复和同源重组等促进CSC存活的途径，在ac4Cscore高组中普遍上调（图6E）。接下来，预测了其他四个数据集中每个病人的22个免疫细胞的比例，并将其合并为高和低ac4Cscore组。在ac4Cscore高组和低组之间观察到T细胞类型的不同组成，包括CD4记忆静止型、CD4记忆激活型、滤泡辅助型、调节型和gamma delta型（图6G）。此外，跨数据集的结果还显示各种免疫途径的一致上调，如IL-17信号通路和Fc gamma R介导的吞噬作用（图6E）。总之，ac4Cscore在患者预后、肿瘤干性和免疫浸润方面的预测能力已通过多个数据集得到证实。结果表明，ac4Cscore对其他癌症类型也有作用，包括肺癌和胰腺癌。
06 - ac4Cscore在抗PD1/mTOR治疗队列中的作用
现有证据表明，NAT10介导的ac4C修饰模式与肿瘤干性和免疫细胞浸润有关。因此，作者调查了ac4Cscore是否能表明患者对免疫检查点阻断治疗或抗PD1和抗mTOR群组的靶向治疗的反应。在抗PD1队列中，低ac4Cscore的患者呈现出明显的临床效益，明显延长了总生存期和无进展生存期（图7A）。与低ac4Cscore组相比，高ac4Cscore组的mRNAi升高了（补充图S9A），在这些组中也可以观察到免疫细胞的不同分布（补充图S9B）。此外，低 ac4Cscore 组的 TMB 比高 ac4Cscore 组更强（补充图 S9C），突变率为 14%，而第 20 位突变基因为 6%（图 7B）。采用TIDE方法来评估肿瘤免疫逃逸，虽然两组ac4Cscore表现出不同的结果，但除了功能障碍评分外，这两组之间的TIDE评分和排除评分都没有明显差异（图7C和补充图S9D,E），说明ac4C mRNA修饰应该是参与T细胞功能障碍相关肿瘤免疫逃避的一种新机制。作者还考察了ac4Cscore对患者生存的预测能力，ROC曲线显示，ac4Cscore可以比PDCD1表达或TIDE评分更好地预测病人在12、36和60个月的结果（图7D）。对于那些接受mTOR抑制剂治疗的患者，高ac4Cscore患者的总生存期和无进展生存期比低ac4Cscore患者更差（图7E）。作者还补充了这两组的基因突变情况（补充图S9F），说明高ac4Cscore组的PBRM1和BAP1的突变率比低ac4Cscore组高。上述结果表明，ac4Cscore可以成为预测免疫治疗和靶向治疗患者预后的新型标志物。
四、结论
本研究中作者开发了一个ac4Cscore模型，并证明它是预测患者预后的良好生物标志物。由于ac4Cscore仅由三个基因组成，其易于使用的能力拓宽了其临床应用。本研究首次表明，ac4C相关的mRNA修饰模式可能在通过大量的途径调节肿瘤的内在和外在特征方面发挥重要作用，从而影响患者的预后。并且补充了转录性mRNA修饰在肿瘤发生和发展中的作用。
