作者，Evil Genius

很多组学，大家如果选择学习，就好好学，不要流于表面，真正深入到组学的核心内容。

这一篇我们来补充一下两个多聚体蛋白（四级结构）如何进行分子对接。

两个多聚体蛋白之间的对接，和普通“小分子–蛋白”对接完全不同。核心问题不是“配体进入口袋”，而是：

两个已经具有四级结构/多聚体结构的蛋白复合物，如何寻找它们彼此结合时最合理的界面和空间构象。

例如：

• 蛋白 A：四聚体 A1-A2-A3-A4

• 蛋白 B：二聚体 B1-B2

• 最终研究的是
  A₄ + B₂ → A₄B₂

而不是把 A、B 拆成单链后简单地做一次普通蛋白-蛋白对接。

一、两个多聚体蛋白对接的总体流程

整个过程分成 7 个阶段：

多聚体蛋白A                     多聚体蛋白B
     │                                │
     ↓                                ↓
确定A的四级结构                  确定B的四级结构
     │                                │
     └──────────┬─────────────────────┘
                ↓
        结构预处理 / 质控
                ↓
        判断可能的结合界面
                ↓
       ┌────────┴────────┐
       ↓                 ↓
   ClusPro/HDOCK      HADDOCK
   无约束搜索          有约束搜索
       │                 │
       └────────┬────────┘
                ↓
          大规模构象采样
                ↓
             聚类
                ↓
        界面柔性优化/refinement
                ↓
      能量、界面、稳定性评价
                ↓
        MD模拟进一步验证

目前比较常用的思路是 ClusPro/HDOCK 做初步搜索 + HADDOCK/MD 做进一步精修和验证。ClusPro本身就是针对蛋白–蛋白对接设计的，能够进行刚体采样、聚类并输出代表性模型；HADDOCK则特别适合有实验界面信息的情况。

二、第一步：首先确定“多聚体”到底是什么

这是最容易出问题的地方。

假设蛋白 A 的 PDB：

A.pdb

ATOM ... chain A
ATOM ... chain B
ATOM ... chain C
ATOM ... chain D

那么它可能是：

       A1
      /  \
    A2----A3
      \  /
       A4

即一个 A₄四聚体。

蛋白 B：

B.pdb

chain E
chain F

可能是：

B1 ===== B2

即 B₂二聚体。

这时候真正的对接应该是：

             Protein A
          ┌──────────────┐
          │ A1 A2 A3 A4  │
          └──────────────┘
                  +
          ┌──────────────┐
          │    B1 B2     │
          └──────────────┘
             Protein B

                  ↓

          ┌────────────────┐
          │   A1 A2 A3 A4  │
          │       ││       │
          │      B1B2      │
          └────────────────┘

而不是：

A1 + B1
A2 + B2
A3 + B1
A4 + B2

分别做几个单链 docking。

三、如果两个多聚体已经有实验结构

这是最理想的情况。

例如：

Protein A
PDB: XXXX
Chains: A B C D

Protein B
PDB: YYYY
Chains: E F

首先检查：

1. 多聚体是否是真实生物学组装？

不能单纯看到 PDB 有 4 条链，就直接认为它是四聚体。

需要确认：

• Biological Assembly

• PDB Assembly

• 晶体接触

• 对称性

• 文献报道

• PISA分析

• 是否存在稳定的链间界面

尤其是晶体结构中经常存在：

生物学多聚体
        ≠
晶体堆积产生的多聚体

四、第二步：蛋白结构预处理

建议先进行：

PDB
 │
 ├── 删除水
 ├── 删除不需要的buffer分子
 ├── 删除无关配体
 ├── 检查缺失残基
 ├── 检查alternate location
 ├── 检查occupancy
 ├── 检查链ID
 ├── 检查原子名称
 └── 检查多聚体完整性

例如：

grep "^ATOM" A.pdb | awk '{print $5}' | sort | uniq

检查 A 有哪些链。

再检查 B：

grep "^ATOM" B.pdb | awk '{print $5}' | sort | uniq

五、如果蛋白是 AlphaFold 预测结构

这个情况要更加谨慎。

例如得到：

Protein A
AlphaFold monomer
        ↓
A1

Protein B
AlphaFold monomer
        ↓
B1

但实际上：

A = A4
B = B2

那么不能简单地：

A1 + B1

然后认为得到了：

A4B2

应该先确定：

A1 → A4
B1 → B2

再研究：

A4 + B2

对于多链复合物，也可以直接采用 AlphaFold-Multimer/ColabFold 类方法进行复合物预测。AlphaFold-Multimer就是针对多链蛋白复合物预测开发的，并且可以通过不同随机种子获得不同复合物构象。

六、第三步：确定两个多聚体之间可能的结合界面

这是蛋白–蛋白 docking 中非常重要的一步。

假设：

Protein A
        ┌───────────────┐
        │               │
        │       ●●●●    │ ← 可能结合区域
        │               │
        └───────────────┘

Protein B
        ┌───────────────┐
        │    ●●●        │ ← 可能结合区域
        │               │
        └───────────────┘

如果已经知道：

• 突变位点

• Co-IP

• Pull-down

• Cross-linking/MS

• HDX-MS

• NMR chemical shift perturbation

• Alanine scanning

• 已知结合残基

就可以把这些信息作为 docking restraints。

这时候 HADDOCK尤其合适，因为它可以把实验界面信息转化为 active/passive residues 和距离约束。HADDOCK的典型蛋白–蛋白流程包括刚体对接、界面柔性优化、进一步精修和聚类。

七、如果完全不知道结合界面怎么办？

如果：

两个蛋白之间的结合界面完全未知

那么应该首先进行：

Blind protein-protein docking

例如：

A4
+
B2
 ↓
大量空间取向
 ↓
筛选
 ↓
cluster
 ↓
得到若干候选界面

ClusPro就是非常适合这一阶段的工具之一。其基本思想是产生大量蛋白–蛋白相对取向，然后按照能量和结构相似性进行聚类，最终保留代表性模型。

八、第四步：刚体蛋白–蛋白对接

和 AutoDock Vina 有一个非常重要的区别：

小分子 docking

蛋白
  │
  └──── 固定/半柔性

配体
  │
  ├── translation
  ├── rotation
  └── torsion

而蛋白–蛋白 docking 通常首先考虑：

Protein A
    │
    ├── translation
    └── rotation

Protein B
    │
    ├── translation
    └── rotation

也就是说首先大量搜索：

两个蛋白整体之间的相对位置和方向。

ClusPro的FFT-based docking就是典型的这种大规模刚体采样思路；其物理评分考虑范德华、静电以及知识库势等因素。

九、第五步：为什么不能只看 docking score？

这是多聚体蛋白 docking 最重要的问题之一。

假设得到：

不能简单认为：

-950最好

因为：

Score
+
Cluster size
+
Interface quality
+
Steric clash
+
Electrostatics
+
Hydrogen bonds
+
Salt bridges
+
Buried surface area

应该综合判断。

ClusPro的结果本身就强调 cluster，而不是单纯依据一个最低能量模型；其输出模型是低能量构象聚类后的代表结构。

十、第六步：多聚体体系尤其要看“界面”

例如：

Protein A
        ███████████
       █████████████
      ███████
             ╲
              ╲
               █████████
               █ Protein B
               █████████

真正需要分析的是：

A的界面残基
        ↓
Axxx
Axxx
Axxx
        ↕
Bxxx
Bxxx
Bxxx
        ↓
B的界面残基

重点分析：

1. 接触残基

例如：

A:ASP125
      │
      │ 3.2 Å
      ↓
B:ARG78

2. 氢键

A:SER120 ───── B:ASP84

3. 盐桥

A:ASP125(-)
       │
       │
B:ARG78(+)

4. 疏水相互作用

A:PHE
A:LEU
A:VAL
       ↓
     接触
       ↑
B:ILE
B:LEU
B:MET

5. buried surface area

也就是：

两个蛋白结合以后，有多少表面积被埋藏。

通常一个合理的蛋白–蛋白界面应该具有比较明显的 buried surface area，而不是只有几个孤立接触点。

十一、第七步：界面柔性优化

刚体 docking 得到：

A
████████

        B
        ████████

但真实蛋白结合时：

A
████████
   ↓ 局部构象变化
████████
       ╲
        ╲
         B
        ████████

所以一般需要：

Rigid-body docking
        ↓
Interface refinement
        ↓
Flexible side-chain optimization
        ↓
Energy minimization

HADDOCK的典型流程就是：

Rigid-body
    ↓
Semi-flexible refinement
    ↓
Explicit-solvent refinement
    ↓
Clustering

HADDOCK3目前也提供在刚体采样后进行聚类、柔性 refinement 和进一步能量/MD精修的流程。

十二、对于“两个多聚体”推荐的方案

如果情况是：

Protein A = A4
Protein B = B2

建议：

路线一：完全不知道界面

A4
│
├── ClusPro
│
├── HDOCK
│
└── AlphaFold-Multimer
        ↓
候选复合物
        ↓
Cluster
        ↓
筛选共同出现的界面
        ↓
HADDOCK refinement
        ↓
MD

这是比较稳妥的方案。

路线二：知道部分结合残基

例如实验已经发现：

A:
ASP120
GLU125
ARG128

B:
LYS75
ARG80
TYR83

那么：

A4
+
B2
 ↓
HADDOCK
 ↓
Active residues
Passive residues
 ↓
Rigid-body docking
 ↓
Flexible refinement
 ↓
MD

这种情况下通常比完全 blind docking 更有针对性。

十三、如果两个多聚体本身也存在对称性

这个情况特别重要。

比如：

A4：

       A1
     /    \
   A2      A4
     \    /
       A3

它可能存在：

C4 symmetry

而 B₂可能是：

B1 —— B2

C2 symmetry

那么：

A4 + B2

理论上可能产生很多不同的结合方式：

方案1       方案2       方案3

 A4          A4          A4
██████      ██████      ██████
  BB          B           BB
              BB

所以不能只看一个 docking pose。

应该重点看：

是否有多个独立 docking 方法都支持相似的 interface。

十四、AlphaFold-Multimer 可以作为重要的独立证据

如果两个蛋白的序列比较可靠，而且有足够的MSA信息，可以直接：

Protein A sequence
        +
Protein B sequence
        ↓
AlphaFold-Multimer
        ↓
A-B complex

如果是：

A4 + B2

则需要按照实际 stoichiometry 构建多链输入：

A A A A B B

而不是：

A B

这样才能让模型尝试预测完整的多聚体组装。

不过，AlphaFold-Multimer结果不能简单等同于实验结构。尤其需要查看：

• pTM

• ipTM

• PAE

• interface PAE

• interface contacts

• 不同seed是否得到相似构象

AlphaFold-Multimer的研究和后续评估表明，多链复合物预测虽然明显提升了界面预测能力，但不同体系的可靠程度仍然存在差异。

十五、最后一定要进行 MD 验证

如果目标是做比较完整的计算结构生物学分析，建议最终：

           A4
           +
           B2
           │
      Protein docking
           │
      ┌────┼─────┐
      ↓    ↓     ↓
   ClusPro HADDOCK AF-Multimer
      │    │     │
      └────┼─────┘
           ↓
       Consensus
           ↓
      最佳复合物
           ↓
       GROMACS
           ↓
 ┌─────────┼─────────┐
 ↓         ↓         ↓
RMSD      Rg       H-bond
 ↓         ↓         ↓
Interface stability
           ↓
       MM-PBSA

最终可以分析：

十六、最终可以形成一张非常漂亮的分析图

做成：

        Protein A4
      ┌─────────────┐
      │             │
      │   Interface │
      │     ████    │
      └──────┬──────┘
             │
        3.2 Å H-bond
             │
      ┌──────┴──────┐
      │   Interface │
      │             │
      └─────────────┘
        Protein B2

        ↓

Interface residues
        ↓
H-bonds
Salt bridges
Hydrophobic contacts
        ↓
Docking score
Cluster size
        ↓
MD stability
        ↓
MM/PBSA

多聚体蛋白对接和普通蛋白–配体 docking 最大的区别

可以简单记住：

特别提醒：如果两个蛋白已经分别是多聚体，千万不要默认把每条链拆开分别 docking。应先确定 biological assembly 和 stoichiometry，再把整个 Aₙ 和 Bₘ 作为两个 docking partner。

生活很好，有你更好。