前言

假设这是我们的RNA-seq数据

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我们可以注意到，它们每个基因的长度和深度均不相同，这样我们计数的count就没有什么可比性
那么我们简单介绍下什么是测序深度：比方说rep1测了100条reads，rep2测了150条reads，rep3测了200条reads
那么测得越多，某基因捕捉到的reads数越多，但如果测序深度不同，两个rep就没有可比性
接下来我们再讨论下基因长度所带来的影响，根据比对的原理，如果一个基因长（一般reads长度是150bp）那么它捕捉到的reads就多（reads比对上的可能性就高），反之则少，所以长的基因捕捉到的reads多，不见得它的表达量就一定高（这纯属比对原理导致的），所以我们也会对长度进行校准

RPKM

1. 对测序深度进行校准

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我们可以看到rep1的深度（total reads）是35；rep2的深度（total reads）是45；rep3的深度（total reads）是106
这里为了好计算，把各个重复的测序深度都除以10
然后再除以对应rep的total reads

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2. 对基因长度进行校准

我们可以看到各个基因的长度也不是一样的，所以要校准

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然后每个rep除以对应基因的长度（单位kb）

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RPKM用于单端测序，由于每个mRNA仅有一个read比对上去，所以计算每个基因read的数目就是计算每个基因表达的mRNA数目

值得注意的是，这里所述的基因长度指的是总的外显子长度，并且去除过多的重叠的外显子的部分

FPKM

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RPKM和FPKM概念比较相近，FPKM用于双端测序，RPKM用于单端测序，FPKM由于每个mRNA相应会有两个reads比对上去，所以较RPKM来说，FPKM不会根据reads来计算，而是根据两个reads比对上的那个片段来计算。fragment即为这个意思

TPM

根据RPKM，我们类比TPM

1. 对基因长度做校准

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2. 对测序深度做校准

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比较RPKM和TPM

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我们可以看到，采用RPKM标准化后，每个rep标准化后的总reads数是不同的，但是TPM是相同的，所以采用TPM可以更好的比较各样本间某基因的表达情况

CPM

我们这次主要讲一种新的标准化方式CPM

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对应样本对应基因的count数除以该样本总的count数再除以1000000

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这仅仅是基于基因count的标准化