有许多基于重要表观蛋白的靶向抑制剂目前在临床上表现较好，例如早期被FDA批准的DNMT1抑制剂（5-azacytidine）以及近年来临床试验表现良好的EZH2抑制剂、HDAC抑制剂、DOT1L抑制剂、BRD4抑制剂等，许多已经进入2期或3期临床试验了，再加上最近靶向表观蛋白与肿瘤免疫治疗抗体的联合使用在临床前试验中显现出了较好的效果，基于表观遗传的靶向药物开发受到了广泛的重视。基于组蛋白甲基转移酶EZH2开发的抑制剂目前进入临床试验的尽管至少有8种，但是目前仍然面临着推进速度慢的系列问题。刚刚在Cell在线发表的这篇来自中科院上海药物所的文章聚焦EZH2抑制剂对部分实体瘤无效的问题，提出了可能的协同抑制表观遗传交互调控解决方案，这对加快EZH2的临床试验具有重要的意义。
背景介绍
- EZH2基因突变或异常上调在人类癌症中经常发生，并且高表达与低预后相关，然而EZH2抑制剂(EZH2i)的临床疗效仍不令人满意，仅限于某些血液系统恶性肿瘤。
- EZH2是组蛋白甲基转移酶，是PRC2（poly-comb repressive complex 2）的亚单位，主要作用是催化H3K27甲基化。开发的抑制剂为EPZ-6438和GSK126在包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和滤泡性淋巴瘤在内的一小部分携带EZH2基因突变的血液恶性肿瘤中显示出初步的益处。
- 目前研究报道，EZH2在体内增多有两种方式：1.在一小部分血液肿瘤中突变；2.在大多数实体肿瘤中，EZH2以过表达的野生型形式存在，同样具有H3K27me的催化活性。
拟解决问题
EZH2抑制剂对部分实体瘤无效的问题，提出了可能的协同抑制表观遗传交互调控解决方案。
H3K27 Acetylation Upregulation Is Associated with the Resistance to EZH2 Inhibition
验证EZH2在不同肿瘤细胞系中的表达情况，这些肿瘤中的大多数都表现出高水平的EZH2表达
用EPZ-6438和GSK126这两个正在临床开发的有效的EZH2药物来检测细胞对EZH2抑制的敏感性。正如预期的那样，血液肿瘤细胞系通常对EZH2is更敏感。20株血液癌细胞中有11株的IC50(半数抑制浓度)在1 mM以下，而实体瘤细胞的敏感性相对较低。
EZH2敲减之后，H3K27me3均减少，但是细胞增殖没有被抑制
EZH2和PRC2复合体与H3K27me关系密切
为了系统地鉴定与EZH2抑制剂敏感性相关的表观遗传标记，他们选取2株敏感细胞和4株不敏感细胞，通过基于SILAC的质谱分析比较了111种组蛋白标记在EZH2抑制剂处理前后的变化
总共鉴定了111个组蛋白标记，分别属于13种类型的组蛋白修饰。
1-4: insensitive: U2932, SMMC-7721, T47D and SU-DHL-4 cells cell lines
5-6: sensitive: Pfeiffer and KARPAS-422 cells lines
此外，敲除PRC2复合体的SUZ12亚基或使用EED靶向抑制剂也可以类似地诱导H3K27ac上调，这表明其具有依赖于PRC2复合体的功能
为了进一步确定H3K27ac的反馈性增加是否与EZH2i的应答有关，作者检测了43个具有代表性的癌细胞系中H3K27ac的变化
那些药物治疗后H3K27ac水平较高的人对EZH2is的抵抗力更强，提示H3K27ac升高与EZH2耐药有关（H3K27ac was detected by immunoblotting）
有趣的是，在带有SWI/SNF或BAP1突变的癌细胞中，H3K27ac的升高也与对EPZ-6438的耐药性有关
这些结果表明，H3K27ac的相互改变与细胞对EZH2抑制的反应性有关，提示H3K27ac的上调可能与EPZ-6438的耐药有关
MLL1 Facilitates p300-Catalyzed H3K27ac Elevation
已知H3K27ac由p300/cbp复合物催化
SMMC-7721 cell :p300和CBP的缺失几乎完全逆转了EPZ-6438诱导的H3K27ac蓄积
p300和CBP的缺失几乎完全逆转了EPZ-6438诱导的H3K27ac蓄积
使用两种靶向p300/CBP复合物的抑制剂C646或SGC-CBP30也获得了类似的结果
这些结果表明，H3K27ac的上调可能是由p300驱动的。
我们怀疑可能还有其他p300结合伙伴参与允许H3K27me-H3K27ac反馈交换。因此，我们检查了建议的p300结合伙伴在不同癌细胞系中的表达水平。有趣的是，UTX、DUX4、CBX2、CBX6等的固有表达水平出现了很大的变化
在所测试的蛋白中，MLL1在敏感和不敏感细胞中的表达存在显著差异，这似乎与H3K27ac对EZH2i的反应有关。
我们还发现p300和CBP之间的相互作用受到MLL1基因敲除的影响
此外，MLL1、p300和CBP形成了一个复合体，任何一个组分的干预都会破坏它们的相互作用
更重要的是，MLL1的敲除降低了H3K27ac的内源性水平，并逆转了EZH2is诱导的H3K27ac的反馈增加
重组MLL1增加EZH2抑制后的H3K27ac，并削弱细胞对EZH2i的反应
这解释了在Pfeiffer、Karpas-422和WSU-DL-CL2细胞中没有H3K27ac增加的原因，在这些细胞中几乎没有检测到MLL1的表达
我们发现不敏感细胞系(U2932，SMMC-7721)比敏感细胞系(Pfeiffer)有更多的致癌特征被统计富集(假发现率[FDR]q<0.05)。
接下来，我们比较了两个不敏感细胞系U2932和SMMC-7721之间显着丰富的致癌特征。结果表明，在RNA-SEQ数据和蛋白质组数据中分别富集了53个和22个常见的致癌特征(图3B和3C)。
此外，一些致癌特征仅在某些癌细胞系中富集。例如，来自RNA-SEQ的101个和12个唯一签名分别在U2932和SMMC-7721中进行了统计富集(图3B)。在蛋白质组数据中，U2932和SMMC-7721细胞分别富集了42个和23个独特的特征(图3C)。
U2932细胞系具有代表性的致癌特征MYC_UP.V1_up、MEK_UP.V1_up显著富集
值得注意的是，一些癌基因的启动子区域被h3k27ac富集，这些区域也显示mll1和p300的结合增加。
用H3K27ac抗体对SMMC-7721细胞进行CHIP-seq分析发现，经EZH2抑制后，Wnt途径的关键成分CTNNB1基因(编码b-catenin)的TSS区H3K27ac表达增加。
用覆盖CTNNB1启动子6个区域的引物进行CHIP-qPCR分析，证实了这一结果。在甲基化水平降低的同时，EZH2i显著提高了这些区域的H3K27ac水平
相应地，我们检测到CTNNB1的mRNA水平增加了约5倍(图3H)，并且在抑制EZH2的同时蛋白水平也增加了
TCF荧光素酶报告实验也证实了EZH2i对Wnt途径的功能激活
此外，应用BRD4抑制剂损害H3K27Ac介导的转录，可以在很大程度上逆转EZH2i上b-catenin的增加,提示EZH2的抑制增加了H3K27ac导致Wnt途径的激活。
综上所述，这些结果表明，由于EZH2抑制导致H3K27ac上调，导致多个癌途径以细胞环境依赖的方式转录激活，这可能突显了对EZH2i的抗性。
Intervention of H3K27 Acetylation Sensitizes Cancer Cells to EZH2i
与BRD4抑制剂(EZH2-BRD4抑制剂组合)的联合使用显著提高了EPZ-6438在跨越血液和实体肿瘤的11种细胞系中的疗效。联合指数(CI)值的测定清楚地表明EPZ-6438和JQ1在11个耐药细胞系中具有协同作用
在U2932异种移植模型中，EPZ-6438每日单次给药高达200 mg/kg对肿瘤的治疗效果不明显。与上述结果一致的是，瘤内H3K27ac的水平分析显示，EPZ-6438治疗后H3K27ac的表达显著增加。相反，EZH2-BRD4抑制剂组合明显抑制肿瘤生长，TGI率约为86.4%
在两个HCC PDX模型中，单用EPZ-6438几乎不能抑制肿瘤生长，这在很大程度上概括了EZH2靶向治疗的临床结果。EPZ6438刺激的肿瘤组织中H3K27ac水平的升高与此相似。EPZ-6438与BRD4抑制剂(OTX015)联合治疗几乎完全阻断肿瘤生长
为了进一步证实这些发现，我们选择了12个癌细胞来源的异种移植(CDX)模型,在大多数模型中，BRD4抑制剂的引入大大提高了EPZ-6438的治疗效果，其中TGI比率增加了104%。在20个模型中，8个模型对EPZ-6438-JQ1组合或EPZ-6438-OTX015组合有明显反应，TGI率超过60%。
在有反应性的Pfeiffer肿瘤中，MLL1水平几乎检测不到(图S4C)，证实了MLL1的上述作用。
Blockage of H3K27 Acetylation Signal Context-Dependently Activates MAPK Pathway
根据我们的结果，H3K27me和H3K27ac的同时干预显示出显著的治疗前景，但仍然局限于部分癌症。因此，我们进行了基于定量质谱的蛋白质组学分析，以比较U2932和SMMC-7721细胞中富集的显著致癌途径的差异。结果表明，单独用EPZ-6438处理的U2932细胞中多种致癌途径显著富集，而EPZ-6438-JQ1联合处理的U2932细胞中仅有极少数致癌途径富集。相反，在SMMC-7721细胞系中，与EPZ-6438单独处理相比，EPZ6438-JQ1联合处理后仍有相当大比例的致癌途径被富集(图5A和表S5)。这些发现为EZH2-BRD4联合治疗的不同反应提供了解释。
值得注意的是，经EPZ-6438-JQ1联合处理的SMMC-7721细胞中仍有相当多的致癌途径被富集。其中一些通路，如KRAS.DF.V1_up和AKT_UP.V1_up，参与了重要的磷酸化信号级联(图5A和表S5)。这可能表明表观遗传改变和信号激酶网络之间存在串扰
用磷酸化蛋白质组分析比较EPZ-6438和JQ1联合处理U2932和SMMC-7721细胞。事实上，基于KEGG数据库的磷酸化蛋白质组改变的富集分析显示，在两种细胞系中，包括FOXO、mTOR、MAPK、胰岛素和ErbB信号通路在内的多条通路受到EZH2BRD4抑制剂组合的不同影响
特别值得注意的是，在U2932和SMMC-7721细胞中，MAPK通路中的关键磷酸化位点及其调节蛋白受到不同的调控，提示SMMC-7721细胞中存在MAPK通路的激活
我们还在U2932和SMMC-7721细胞中构建了一个受EZH2-BRD4抑制剂联合处理显著调控的磷酸化蛋白组间相互作用网络
为了了解MAPK通路是如何受到不同影响的，我们在一组对EZH2单一抑制或EZH2-BRD4抑制剂组合显示不同敏感性的癌细胞中检测了该通路中主要成分的磷酸化和蛋白表达水平。有趣的是，在对EZH2i有反应的Pfeiffer和HT细胞中，我们观察到磷酸化ERK的下调与H3K27ac的积聚平行
ERK2在不敏感细胞系中上调，随着ERK2的激活，我们也观察到所有不敏感细胞中ERK1蛋白的减少
已显示ERK1在与上游MEK的结合中与ERK2具有竞争性竞争，而ERK1的下调可能导致ERK2以细胞背景依赖性的方式激活
使用两个独立的小干扰RNA（siRNA）耗尽ERK1编码基因MAPK3导致SMMC-7721和ZIP-177细胞中ERK2的激活
此外，JQ1或EZH2-BRD4抑制剂组合降低SMMC-7721和ZIP-177细胞中MAPK3 mRNA的水平，表明ERK1的转录下调。相反，编码ERK2的MAPK1的mRNA水平几乎没有变化
使用BRD4 siRNA进一步证实了这一结果，该RNA类似地降低了MAPK3 mRNA水平，而不会影响MAPK1
这些数据共同表明，H3K27ac的干预可能通过癌细胞亚类中ERK1的转录下调导致MAPK信号的反馈激活。
Combined EZH2, BRD4, and ERK Inhibition Shows Striking Anticancer Effect in Solid Tumors
BRD4介导的ERK信号反馈激活提示MAPK的阻断可能会进一步扩大治疗效果。
在肝癌PDX-0273模型中，单独使用EPZ-6438和OTX015对肿瘤生长的影响不明显,令人鼓舞的是，EPZ-6438、OTX015和ERK1/2抑制剂GDC-0994三联用几乎完全抑制了肿瘤生长(TGI%，99.1%)，而不是EPZ-OTX015联合治疗(TGI%，67.0%)。具体地说，EZH2i提高了H3K27ac的瘤内水平。BRD4抑制剂的引入引起ERK信号的反馈激活，GDC-0994可完全阻断该作用
在肝癌PDX-0273模型中，单独使用EPZ-6438和OTX015对肿瘤生长的影响不明显,令人鼓舞的是，EPZ-6438、OTX015和ERK1/2抑制剂GDC-0994三联用几乎完全抑制了肿瘤生长(TGI%，99.1%)，而不是EPZ-OTX015联合治疗(TGI%，67.0%)
这些治疗都没有明显的全身毒性，也没有对小鼠的体重有显著影响
总之，这些数据表明，同时针对MAPK信号转导可能提供一种治疗选择，以进一步提高基于表观遗传的治疗效果，包括缺乏有效临床治疗的肝癌和胰腺癌。
