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1. 作者介绍
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作者介绍1
本文的作者是四川农业大学的园艺学院的博士，由于是我们课题组的，因此有一点自吹自擂的嫌疑。该文刊登的期刊影响因子2~3，不算顶级期刊。
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作者介绍2
本文发表时间为2018年，引用次数少，然而为什么要解析这篇文章主要有两个原因。首先是因为这篇文章为我们实验室的文章，因此比较了解相关的研究方法，分析起来比较得心应手。其次，由于此类文章是近几年的一类常见的文章，并且实验技术不算丰富然而却有很多期刊接收此类文章，因此这种套路文章的适当发表对于毕业和升学比较有意义。
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2. 全文翻译
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摘要
摘要
背景：
草莓由于它的营养价值、独特的香味和诱人的外观已经获得了大量的关注。全基因组测序以及转录组数据库的建立为系统地研究基因功能提供可能。目标基因表达数据为了解其生物学功能提供了线索。实时定量PCR（RT-qPCR）是快速研究基因功能的良好方法。这个方法需要稳定表达的参考基因（reference gene）来均一化数据从而得到精确可靠的数据结果。
结果：
在此研究中，我们采用了3种数据算法（geNorm、NormFinder and BestKeeper）分别检测了个候选基因在不同组织和果实大于时期以及不同光质处理下（plant subjected to ... treatment ）和低温处理下的基因表达稳定性。结果表明在不同实验环境下的基因参考基因表达均有变化（这个是第一个结果， varied under different treatments ）。总体来讲，DBP，HISTH4，ACTIN1和GAPDH表达更为稳定，而PIRUV，ACTIN2和18S在我们的实验中不作为推荐的参考基因因为其较低的稳定性（due to）（这个是第二个结果）。此外，相关的基因HY5表达模式被用来确认参考基因的可靠性（验证结果），从而证明了在定量PCR中正确选择内穿基因的重要性（was of great importance)
结论：
草莓内参基因的表达稳定性（expression stability）在我们选择的实验条件下具有差异性（varied across）。对内参基因的系统性研究应该优先于研究目标基因表达水平以此来提供一个精确的均一化结果。
前言
前言1
在信号转导以及代谢机制和转录调控网络的研究中，对基因表达的研究反应目标基因的mRNA丰度和转录水平，进而为基因功能提供思路。RT-qPCR具有快速、特意和敏感以及重现性（reducibility）已经成为确定基因表达以及核实高通量数据结果的可靠方式。
前言2
然而，RT-qPCR的精确性依赖于许多的变异，包括mRNA的模版质量和含量、引物扩增效率、样品的基因型以及不同的组织和发育过程、不同生物或非生物胁迫等。因此，一个基本的先决条件（prerequisite）就是均一化过程来减少这些差异。目前最通用的作为qPCR的均一化方法是运用参考基因，但是采用不合适的（inappropriate）参考基因可能造成显著地数据差异和误差。最终造成不精确甚至是错误的结果（erroneous results）一个理想的参考基因是具有一致的表达量在各种条件并且不能受到实验参数的影响。但是，在植物和动物中，并没有一个通用的参考基因被鉴定出来。许多之前的研究直接选择传统的参与基本细胞过程、初级代谢和细胞结构稳定相关的基因，如18S染色体（18sRNA）、微管蛋白（tubulin TUB）、泛素化（ubiquitin，UBQ），激动蛋白（actin，ACT）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）来标准目标基因的表达而不评估基因的表达稳定（这个有点不明白）。然而，实际上有标明这些参考基因不是一直都可以保持稳定的表达在不同的环境下。此外，一些研究者指出当单一参考基因无法满足实验要求的时候两个或者多个内参需要使用。因此选择和确认参考基因应该在qPCR均一化之前进行。
前言3
草莓是广受欢迎的果树作物，并且具有良好的香味口感与质地。。尤其是富含有益于人类的营养物质如微维生素、矿物质与抗氧化物质，而这些物质近两年来受到植物育种者、视频生产者和消费者的关注。这些草莓的特点涉及到许多复杂的代谢过程并受到内在和外在因素的调控影响相关基因的表达。因此对于基因表达的趋势研究可为揭示关于遗传背景、胁迫等相关的（regarding）的分子机制提供有用的信息。于是（Accordingly），鉴定稳定的参考基因来获得可靠精确和高精度的基因表达分析数据。最近对于草莓参考基因的表达仅仅局限于某些栽培品种和实验条件下。
前言4
前言5
在本实验中，选择了7个候选基因并用qPCR的方式在不同的组织、果实和7个发育时期以及光质处理和冷处理的样品中进行评估。此外，采用三种不同的数据算法包括geNorm、NormFinder和BestKeeper来计算参考基因的稳定性从而得到在这些实验处理中合适的参考基因。
方法材料
方法与材料1
植物材料与处理
‘丰香’草莓品种作为研究候选参考基因表达稳定性的材料，栽培与15 cm × 13 cm 的盆中，土壤为营养土、园土和珍珠岩（perlite）以2:2:1（v/v/v)比例混合,并且依照常规管理（was subjected to rutine management ）在四川农业大学大棚中。特意组织（根，茎，叶，花）以及不同的果实发育时期（小绿，大绿，白果，转红，半虹，红熟，全红）时期被采集用于评价参考基因。同时，盆栽草莓（portted Strawberry）在白果时期被用于低温处理（subject to）两组材料放置于4度（冷处理）和25度（对照）持续0/6/12/24/48/72小时，光周期为16h白昼（diurnal light ）在 100umol m-2 s-1 和 75% 相对湿度环境下。
为了筛选稳定的参考基因用于均一化草莓在不同光质处理中的qPCR的数据分析。盆栽草莓（丰香）在花后7天的时候分为4组，放入生长箱中进行处理。处理环境为8h黑暗 16度，光照16h 25度和75%相对湿度。白色光、红色光（730nm）、蓝色光（450nm）以及红蓝1:1 混合光照LED被放置在培养箱顶部用于光源对草莓苗进行照射100umol m-2 1-s 直到果实成熟。果实在花后14/21/25/28天的时候进行采收。
方法与材料2
总RNA的提取和cDNA首链合成（first strand cDNA synthesis）
将采集得到的样本采用改良的CTAB方法进行总RNA提取 。将质量分析后的RNA取1ug采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 参照说明书 （manufacture‘s instruction）进行反转录成cDNA。 cDNA稀释10倍后用于定量PCR反应。
方法与材料3
选择候选的参考基因以及引物设计和核实
总共7个候选基因用于评估，这些基因基于草莓之前的工作进行选择包括ACTIN，18S 核糖体RNA （18s RNA），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），DNA 结合蛋白 （DBP）和组蛋白H4（histone H4 ,HISTH4),丙酮酸羧化酶（pyruvate decatboxylase， PIRUV）。引物在表一，通过Primer Premier 5.0 软件或者由参考已发表的文章进行。qPCR前，每个引物通过在线Primer-Blast 进行检测其发夹结构、二聚体和特异性扩增子长度（amplicon specific-size）。
材料与方法4
采用SYBR Green 进行的 RT-qPCR
RT-qPCR在CFX96 实时PCR系统上进行。所有的反应都采用SYBR Green Primer Ex Taq TM （Takara ，Japan）采用三个技术重复，反应体系为10ul。反应方案采用三步法。熔解曲线放置用于合适引物扩增的特异性（to verify specificity of primer amplification ）。无模版对照在每个反应中用于检测潜在的试剂污染。此外，对于每个基因，所有的样品在同样一个板子中进行用于排除技术变异和板间差异。并采用不同稀释浓度的cDNA为模版构建标准曲线从而计算扩增效率（Amplification efficiency ）和相关系数（correlation coefficienchy）。
数据分析
受试基因的表达水平通过在某一个特定阈值（a specific threshold）的扩增循环数进行确定。三种不同的基于Microsoft Excel 的软件（BestKeeper， goNorm ，NormFinder）用于确定参考基因的表达稳定性。BestKeeper分析原始Cq值而得到最低的标准差（standard deviation，SD）而确定最稳定的基因。geNorm和Normfinder 通过获取Cq值进一步转换为相对表达量进行评估。在geNorm 参考基因具有最低配对变异即为最稳定的基因，而在NormFinder中，参考基因最稳定的到最不稳定的基因基于稳定值和进行排序，而追最第稳定性的为最稳定的基因（这个地方有点问题，我需要进一步核实关于算法和结果分析）
方法与材料5
方法与材料6
验证参考基因
FaHY5，是一个bZIP转录因子用于检测参考基因。该基因参与了植物发育，信号转导和胁迫响应。引物序列为：（这个就不说了）。选择在各个处理中最稳定的参考基因和最不稳定的基因分别作为参考基因以用于计算FaHY5的表达量。
结果
结果1
候选基因的扩增特异性和效率（amplification specificity and efficiency）
7个候选基因的特意引物被用于qPCR，扩增长度为72到219bp。6个引物对是采用前面的研究中使用的扩增引物。ACTIN1的引物采用引物涉及软件Primer Premier 5.0 并且通过PCR产物电泳检测其扩增产物的单一性。此外，熔解曲线分析单一峰表明所有引物的特异性（Fig 1），同时（meanwhile）无模版对照组中没有检测到信号。RT-qPCR扩增效率从86%（18S）～108%（DBP），线性皮尔森相关系数（R^2）0.990～0.999.
Fig 1
Table 1
结果2
候选参考基因的表达
定量循环数（Cq）在qPCR中被定义为荧光信号达到基线阈值所对应的扩增循环数进而用于鉴定基因表达水平的差异。在本研究中，Cq值提供了7个基因的的基因表达水平在三个实验亚组中，包括不同的组织、不同的果实发育水平和不同关照处理中。结果显示，18S在三个实验亚组中白哦大量最高，具有最低的平均Cq值（12.37,12.81和13.85）。相反，ACIN2的表达量为最低，具有最高的平均Cq值（with the lowest mean Cq value）在三个实验亚组中。此外ACTIN2，PIRUV和18S表达出较大的基因表达变异在所有亚组中，根据箱线图大小和虚线长度可以得到，然而HISTH4和DBP以及GAPDH变异程度较小并且表达量适中。有趣的是，ACTIN1的Cq值在处理亚组中表达集中（values are intensive)，而在冷胁迫中的表达却明显高于其他处理亚组中的Cq值。七个基因的较大的表达量变化（wide expression range ）表明没有一个参考基因可以在不同的样本中具有抑制的表达量（constant expression）。因此，在特定的实验条件下采用可靠的参考近来均一化基因的表达量是非常有必要的（it is of utmost important to）（这个部分可以和文章后面进行一个讨论）。
Fig2
候选参考的表达稳定性
结果3
7个候选基因的表达稳定性在不同的实验处理样本中得到测定和排序，采用的三种不同的计算方法包括NormFinder，geNorm和BestKeeper。
Table2
采用geNorm分析中，根据平均表达稳定性M对基因进行排序。M值基于对后一个基因与其他测试基因的平均配对变异通过连续排除追捕稳定的参考基因。默认的稳定值M范围是<1.5，因此参考基因的M值小则认为是最稳定表达的参考基因，反之亦然（and vice varsa）。当把所有来自于不同组织和不同果实发育时期样本放在一起分析的时候。DPB和HISTH4的平均表达稳定度较低（M=0.96）而PIRUV具有最高的M值，表明DBP和HISTH4是最稳定表达的参考基因，PIRUV是最大变异表达的基因。GAPDH和DBP在不同的光照处理下的样本中同样表现稳定，PIRUV则是稳定最差的基因。在低温处理亚组中（In the subset of sample under low temperrature stress），所有的候选参考基因M值低于1.5可以被选择为为参考基因，ACTIN1和HISTH4表现的稳定性最好，M值也最低。基于结合所有样本的表达分析显示DBP和HISTH4具有最稳定表达的特性（featured ...)和最打的变异性包括PIRUV和ACTIN2。
结果4
结果5
geNorm软件还可以用于检测用于跨样本均一化的最好的参考基因通过在两个后续的均一化因子中计算配对变异性（pairwise variation）。一个打的配对变异（推荐的默认值为大于等于0.15）表示加入的基因对均一化由于显著的影响而且应该偏向于包括计算可靠的均一化因子。然而Vn/Vn+1 值低于0.15表明额外的参考基因对于均一化过程并不是必须的。在我们的研究中，低温处理亚组中的配对变异V4/V5低于0.15（Fig 3），表明4个基因对于目标基因的均一化是有必要的。而在其他三个实验亚组中V值都大于0.15，即表明采用多个参考基因可能增加实验的的不稳定性和复杂性。因此一个基因也可以用于实现精确的均一化。
结果6
结果 7
参考基因的稳定值通过NormFinder算法进行进一步的计算，并基于评估组间（intra）和组内（inter）变异和样品亚组表达水平的分别计算进行排序。NormFinder的分析结果表明，7个基因的稳定排序与geNorm相对一致。GAPDH是最稳定的基因具在最初的两个实验亚组中，稳定值为0.291和 0.251，然而PIRUV和ACTIN2是最不稳定的基因。HISTH4基因在低温和总体中最稳定，ACTIN2和18S表达量最为变异，并且在低温中具有最大的稳定值（stability value）为最低稳定性的基因。PIRUV和18S在所有的样品中均为最低稳定性的。
Fig 3
结果8
BestKeeper小程序是基于Excel的工具根据Cq值的标准差进行评估参考基因的稳定性。较低的SD-value表示基因更为稳定。BestKeeper排序表明ACTIN1是最稳定的参考基因在不同的组织和果实发育时期的样本中和低温处理的样本中。HISTH4在光质处理下表现更好。以及在全部的样本中，HISTH4也是最好的参考基因。此外，18S、PIRUV和ACTIN2在亚组中表现的总是不稳定，这与前面的NormFinder和geNorm所得到的分析结果是一致的。
结果 9
结果10
结果11
为了验证在某些实验中的参考基因可靠性。FaHY5的相对表达量通过两个最稳定和两个最不稳定的基因作为矫正进行计算。在不同的组织中，采用最稳定的参考基因FaHY5的表达量在花中表达最高，其次是叶片和根，最后是茎。然而采用最不稳定的参考基因会出现明显的偏差。我们发现，FaHY5表达量在采用所有的参考基因的时候都表现出在着色前高表达的现象。但是最稳定的参考基因均一化的结果表明FaHY5的表达量串联变化，而这样的变化通过最稳定的参考基因和最不稳定的参考基因进行矫正的结果有明显差异（obviously differed）（图6）。FaHY5表达水平在红光下受到抑制，当采用GAPDH、DBP、ACTIN2 和 PIRUV作为内参基因，如果忽略统计显著性。在低温处理下，FaHY5相对表达量均已花结果采用两个最为的稳定的参考基因进行均一化的时候是一致的。然而采用最差的参考基因18S和ACTIN2的均一化结果存在很明显的差异（discrepancies）。这个结果表明采用稳定的参考基因对于目标基因的精确均一化具有重要作用。
Fig 4
讨论
讨论1
===阐明参考基因研究的必要性
基因表达可以更好的解基因功能。qPCR是目前最有效和快速的方法对目标基因的表达进行定量，也可以通过采用可靠的参考基因作为内部参考来保证数据的可靠性。优化的参考基因应该在任何条件下都能保持稳定表达。然而这样的参考基因可能并不存在因为参考已经可能在不同的物种、品种、组织和胁迫情况下的表达量会有变化（vary among）。如18S在水稻和病毒侵染的稻谷中稳定表达，但是在其他物种中却表现不好。GAPDH在葡萄和咖啡中表达一致，但是在桃子和小麦中表达不稳定。因此，为了保证在特定实验条件（under certain experimental ）下的结果准确性，参考基因需要提前验证。
讨论2
===对引物的特异性和扩增效率进行讨论
本实验中，7个参考基因被选中并用于提高在包括不同组织与果实发育时期和光质处理以及低温处理下的基因表达数据分析。结果表明这些所设计的引物均具有单一熔解曲线峰而均具有良好的特异性（as a single peak）。此外，qPCR对于每一个参考基因均有高的扩增效率。因此表明我们的引物对于分析参考基因的稳定性是可靠的。
讨论3
讨论4
三种算法geNorm、NormFinder和BestKeeper是常用的评估参考基因的软件。因此，由于不同的数据算法和分析流程而造成的评级差异。比如，在不同组织和果实发育特性中HISTH4，DBP以及ACTIN1在geNorm、NormFinder以及BestKeeper分别评级第一，在光质处理中GAPDH是最稳定的基因在geNorm、NormFinder两个软件，而在BestKeeper中评级为第四（while it was ranked fourth by ...)。 在低温处理中ACTIN，HISTH4和PIRUV被排在前三在三个子集中，然而ACTIN1和HISTH4在NormFinder软件分析中交换了位置，HISTH4和PIRUV在果实受到盐胁迫和干旱胁迫过程中可以作为很好的内参基因。然而HISTH4和ACTING在Benzothiadiazole抗性诱导的果实处理中可以作为最好的稳定参考基因。表2展示ACING2、PIRUV和18S总是处于最后位置，表明这些基因不适合作为实验过程中的内参基因，这和图2中的结果是一致的。在qPCR基因表达的过程中，合适的表达丰度和稳定的表达对于选择参考基因是一个可靠的前提。然而在我们的研究中，ACTIN2，PIRUV和18S在表达量上变异较大。ACTIN2表达量较低，相反18S表达量非常高，而这样对于表达量中等和较低的目标基因不可靠。这样的现象在鉴定不同品种以及在氧化胁迫下的研究中同样有表型，结论为在所有的测试环境下最为不稳定的基因。之前18S rRNA基因被认为是一个理想的RT-qPCR参考基因，但是最近的研究因为其在许多物种中的高量表达而被排除。因此18S在草莓中不作为合适的参考基因作为推荐。尽管在COA和几丁质处理果实中是一个稳定表达。
讨论4
HY5，是bZIP转录因子家族，正调控光形态建成。除了参与植物生长与发育，HY5 还参与色素积累被认为是多个信号通路的整合点如植物激素、营养以及胁迫。为了基因不验证我们参考基因的稳定性，HY5 基因的表达量通过两个最好的和最不稳定的的基因在每个子集中（一共就是4个）。FaHY5基因的表达量均一化结果采用稳定的参考基因作为内参得到的结果相对一致，然而采用变异性最大的基因作为内参的差异很明显，这也表明正确选择参考基因对与qPCR结果的正确性很重要。
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3. 文章梳理
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前言：
- qPCR的优点与广泛使用。（可以结合高通量测序结果的发展进行）
- qPCR过程中内参基因的作用。（罗列一些常用的内参基因）
- qPCR的不可通用性。（应用其他工作来证明，也就可以引出在本研究中的必要性）
- 所研究的植物的研究价值和qPCR在这个过程中的作用。（引用相关物种的内参选择文章）
- 本实验的概括（哪些处理、多少个基因、采用的算法）
