随着单细胞测序技术的发展，单细胞的应用方向也由医学领域逐渐向农学领域拓展，样本类型也不再局限于人、鼠或模式物种，而逐渐发散到各种各样的经济动植物。前几期推文我们介绍了畜牧类物种单细胞的制备与经验，本期我们将走入植物样本，探索植物的单细胞制备研究。目前市面上常见的植物单细胞制备方法有两种，一是原生质体制备，二是植物抽核。
植物原生质体制备
植物单细胞分析主要依赖于细胞壁酶解产生原生质体，通过不同消化酶、不同配比、不同酶解时间的组合，实现原生质体的制备，从而进行后续单细胞的上机研究。诺禾致源根据已有文献参考和大量的实战积累，研发了较为全面的原生质体制备方法，让我们以两篇文献为例，看一看植物原生质体的制备方案。
花生叶片
1. 花生幼苗室温(25℃)下，黑暗条件下生长一周，收集幼苗叶片；
2. 将叶片切成1-2mm的条状，加入含有30mL酶溶液的试管中，酶溶液由3%纤维素酶R-10、1.5%离析酶R-10、0.3%果胶酶Y-23、0.25% BSA、5 mm MES和8% (w/v)甘露醇(不含Ca2+和Mg2+)组成，在25°C下以40 rpm摇2小时；
3. 然后用40μm细胞滤器过滤细胞；
4. 台盼蓝染色法检测细胞活性，显微镜检测细胞浓度；
5. 原生质体在8% (w/v)甘露醇溶液中重悬，上样10x Genomics微流控芯片。
参考文献：Single-cell RNA-seq describes the transcriptome landscape and identifies critical transcription factors in the leaf blade of the allotetraploid peanut (Arachis hypogaea L.), DOI: 10.1111/pbi.13656
拟南芥根
1. 播种后五天，每个样品收集1,000-3,500个初级根，距离根尖约0.5cm处剪断；
2. 样本放入一个直径35mm的培养皿中，含有70µm细胞过滤器和4.5mL酶解液；
3. 酶解液包含1.25% [w/v]纤维素酶，0.1%离析酶，0.4 M甘露醇，20 mM MES（pH 5.7），20 mM KCl，10 mM CaCl2，0.1%牛血清白蛋白和0.000194% (v/v)巯基乙醇；
4. 在摇床上以25℃、85rpm的条件下消化1小时，偶尔搅拌；
5. 将细胞溶液通过40µm的细胞过滤器过滤两次，并以500xg的速度离心5分钟；
6. 用1mL洗涤液，包括0.4 M甘露醇，20 mM MES（pH 5.7），20 mM KCl，10 mM CaCl2，0.1%牛血清白蛋白和0.000194% (v/v)巯基乙醇重悬沉淀物，并在500xg的速度离心3分钟；
7. 沉淀用洗涤液重悬至约1000个细胞/μL的终浓度，上样10x Genomics微流控芯片。
参考文献：A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants, DOI: 10.1016/j.devcel.2022.01.008
植物抽核制备
抽核的优点在于能够从难以酶解消化的植物组织中获取细胞核内的信息进行单细胞研究，对于难以进行原生质体制备的组织、原生质体制备后直径过大，或者需要排除应激反应影响的研究，可以采用植物抽核的方式，通常情况下植物抽核可以搭配流式细胞仪去除碎片，防止仪器堵塞实验失败。
玉米根尖
1. 组织放置在培养皿中，加入500μL LB01缓冲液中：15mM Tris pH 7.5，2mM EDTA，0.5mM Spermine，80mM KCl，20mM NaCl，15mM 2-ME，0.15% TrixtonX-100，切碎处理2分钟；
2. 通过两层miracloth过滤均质化的组织；
3. 用DAPI染色至最终浓度约1μM，并加载到流式细胞术仪器上；
4. 每个样品分选120,000个细胞核，分别装入四个收集管（每个管30,000个细胞核），每个管含有200μL LB01；
5. 分离的细胞核在摇床离心机中离心沉淀（5分钟，500 rcf），重悬于10μL LB01中，混合后在带荧光显微镜的血细胞计数板上进行观察；
6. 将细胞核悬液离心沉淀（5分钟，500 rcf），并重悬于稀释的细胞核缓冲液（10X Genomics）中，最终达到3,200个细胞核/μL的终浓度。
参考文献：A cis-regulatory atlas in maize at single-cell resolution, DOI: 10.1016/j.cell.2021.04.014
玉米叶片
1.10日龄幼苗，使用显微镊子机械剥离大约100个幼苗的叶下表皮，并收集幼苗1cm段叶基，剥离的表皮和叶基样品在冰水中保存，以便进行核分离的前处理；
2.材料吸干后（0.3g鲜重）置于一个5cm直径的一次性无菌塑料培养皿中，含2mL Galbraith缓冲液，并添加了2%牛血清白蛋白、20µL二硫苏糖醇（DTT）（1 M DTT在DEPC处理的双蒸馏水中）、20µL RNase抑制剂1和10µL RNase抑制剂2；
3.用新的双刃刀切碎经过吸干的材料，将均质物通过30µm的细胞过滤器分别过滤，添加PI至最终浓度为50 µg/mL；
4.使用70或75µm的喷嘴进行细胞核的流式分选，0.01M磷酸盐缓冲液（DEPC处理的水）作为鞘液，通常在5-10分钟内，可分选出大约40,000个细胞核；
5.细胞核分选到一个预先用2% BSA漂洗过的2mL蛋白质LoBind离心管，通过相差显微镜预估细胞核完整性，使用细胞计数器确认细胞核浓度。
参考文献：The maize single-nucleus transcriptome comprehensively describes signaling networks governing movement and development of grass stomata, DOI: 10.1093/plcell/koac047
植物的送样建议
植物样本要求
寄送活株，可以使用木架固定培养瓶及幼苗，以保证运输途中植物完整性及状态的稳定性，用于制备的目标组织量建议>2g
制备样本
上机前建议检测指标
a.捕获上机的液体用不含Ca2+，Mg2+的缓冲液
b.AOPI计数，活性指标>60%，实验背景相对干净
关于特殊样本类型
含淀粉样本无法进行原生质体制备，只能抽核处理
如样本涉及真菌侵染、细菌处理、病毒、虫害等处理，需要确认样本详细情况，是否存在寄生，是否存在残留，如有残留、影响别的物种，具有产生交叉污染的风险，则无法进行实验
