How does bisulfite sequencing (WGBS/RRBS) work?
DNA甲基化分析是NGS技术中越来越广泛的一项应用。原因很简单:DNA甲基化是表观遗传修饰的主要机制之一，对基因表达和细胞活性有根本的影响。这是研究细胞发育、转录沉默和发现新的生物标志物的一个有趣的方面。
为什么使用亚硫酸氢盐测序法?
基于NGS的DNA甲基化分析的目的是研究基因组DNA，发现基因组中单个胞嘧啶或整个区域是否甲基化，因为启动子或gene body甲基化会影响基因表达。典型地，在哺乳动物中，DNA甲基化只出现在CpG二核苷酸上，其甲基化率为70 - 85%，而CpG岛则主要是未甲基化的C以保持活性。顺便提一下:在人类中，大约70%的启动子含有一个CpG岛。
目前有几种研究DNA甲基化的方法，但很少能像亚硫酸氢盐测序(也称为Bisulfite-Seq，BS-Seq或Methyl-Seq)一样提供更好的甲基化状态分辨率。这种方法的关键idea是将高通量DNA测序的能力与亚硫酸氢钠处理DNA相结合。当暴露于亚硫酸氢盐中，未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶(包括甲基化的和羟甲基化的)保持不变(图1)。bisulfite处理的DNA测序后，获得的测序reads可以使用专门的比对软件将其比对到原始参考基因组上(图2)（将未甲基化的胞核嘧啶进行转化）。然后，这种比对可以用类似于从NGS数据中检测DNA变异的方式在单核苷酸水平上识别甲基化状态。因此，重要的是要记住亚硫酸氢盐测序不能区分5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，即使它们的功能已经被发现是不同的。
Bisulfite 测序protocols: Large-scale versus small-scale
最简单的方法是做全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)。但是，你需要足够的read深度来准确的判断甲基化状态。当你要进行的测序是基于一个大基因组（小鼠或人）时，这可能导致测序的成本过高。
作为一种可选方法，你可以把检测DNA甲基化的重点放在基因组的一个特定子集上，从而减少实验的数据量和随后的成本。
一种流行的方法是Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS)。RRBS的基本思想是获得基因组的“简化表示（reduced representation）”，重点放在CpG岛上。这包括在裂解阶段添加限制性内切酶来消化DNA。通常，使用的MspI酶是甲基化不敏感的。它在5 ' -C^CGG-3 '位点剪切，由于基因组除启动子/CpG岛外，CpGs大量缺失，“简化表示”主要是只捕获这些启动子区域以供进一步分析。消化反应对两端都有CpG的DNA片段和大小不一的片段进行富集。然后填充片段末端并连接adapters。之后选择片段的大小，进行亚硫酸氢盐转换，并进行测序。
为什么RRBS不可以进行deduplication（去重）？
与切割同一位点的限制性内切酶有关。上面提到了，对于RRBS，你的序列总是从MspI限制性酶切位点开始，那么当你从那里对片段进行测序时，会得到重复的序列，因为它们总是由那些剪切位点开始的。如果你做了去重，你会把大量有用的reads都删掉了。但是，如果你做的是WGBS（全基因组甲基化测序），你的基因组是在随机的地方被剪切的，那么你就不会得到所有的reads都是相同的开头，除非他们是PCR duplicates。
参考：
1.https://www.ecseq.com/support/epigenetics/how-does-bisulfite-sequencing-wgbs-rrbs-work
2.https://github.com/RobertsLab/resources/issues/669
3.http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/training/Methylation_Course/BS-Seq%20theory%20and%20QC%20lecture.pdf
