作者，Evil Genius

生化小课，CADD计算机辅助药物设计已经开启，对分子对接/分子动力学感兴趣的同学可以报名参加，我自己做了个合集，在分子动力学，感兴趣可以关注一下。

在我们的2026年空间转录组系列课程中专门全系列讲解了visium 、visium HD、xenium、CosMx的数据分析，感兴趣可以看一下。

这一篇我们来总结非编码基因（主要是lncRNA）对单细胞、stereo-seq、visium HD分析上的影响。

现在大家拿到单细胞、stereo-seq、visium HD的基础分析报告，看着指标都挺好，实际上相比于原来添加了很多非编码基因，真正可以用的没有基础报告写的那么多。

非编码基因的存在，会怎样影响数据QC、聚类、细胞注释、细胞亚群识别、空间邻域/niche以及细胞通讯分析。

一、先明确：什么叫“非编码基因”？

这里主要包括：

lncRNA（长链非编码RNA）
miRNA
snRNA
snoRNA
circRNA
pseudogene（严格来说假基因并不全部属于“非编码RNA”）
其他ncRNA

其中对于常规：

scRNA-seq / Stereo-seq / Visium HD

最容易在表达矩阵中看到并影响分析的，主要是：

lncRNA、pseudogene、部分其他非编码转录本。

例如：

MALAT1
NEAT1
XIST
GAS5
H19

以及大量：

RP11-xxxx
ACxxxx
ALxxxx
LINCxxxx

二、最重要的认识：检测到的基因 ≠ 有效的生物学信息

这是整个问题的核心。

很多数据QC首先看：

$nFeature = \text{每个细胞检测到的基因数量}$

例如：

Median genes/cell = 3,500

看起来非常好。

但是这3500个基因可能包含：

3500 genes
│
├── Protein-coding genes
│      └── 大量细胞身份marker
│
├── lncRNA
│
├── pseudogene
│
├── ribosomal genes
│
├── mitochondrial genes
│
├── housekeeping genes
│
└── 低信息量基因

所以：

$\boxed{ Detected\ genes \neq Informative\ genes }$

进一步：

$\boxed{ Informative\ genes \neq Cell\ identity\ genes }$

因此，一个细胞：

检测到3500个基因

不一定意味着：

拥有3500个可以用于细胞注释的有效特征。

三、非编码基因对QC的第一个影响：造成“基因数量虚高”

这是最值得强调的问题。

假设两个数据：

Dataset A

Median genes/cell = 3500

Protein-coding = 1800
lncRNA/pseudogene = 900
Ribosomal/other = 800

Dataset B

Median genes/cell = 2500

Protein-coding = 2100
lncRNA/pseudogene = 200
Ribosomal/other = 200

如果只看：

nFeature_RNA

会认为：

A的数据质量更好。

但如果真正关注：

细胞身份信息

B可能反而更加可靠。

所以：

$\boxed{ nFeature高 \not\Rightarrow Annotation信息丰富 }$

四、第二个影响：非编码基因可能成为高变基因

Seurat等分析流程通常会进行：

NormalizeData
      ↓
FindVariableFeatures
      ↓
ScaleData
      ↓
PCA
      ↓
Neighbors
      ↓
Clusters

问题来了：

如果：

MALAT1
NEAT1
XIST
H19
GAS5

在不同细胞之间存在明显表达差异，它们可能进入：

Highly Variable Features

于是：

HVG
 ↓
PCA
 ↓
PC
 ↓
Neighbor graph
 ↓
Cluster

也就是说：

非编码RNA可能直接参与决定细胞聚类。

五、第三个问题：聚类可能更多反映“RNA表达程序”，而不是细胞类型

这是一个非常重要的区别。

理想情况：

CD3D
CD3E
TRBC1
IL7R
NKG7
MS4A1
LYZ
EPCAM
COL1A1

这些基因帮助我们形成：

T cell
B cell
Macrophage
Epithelial
Fibroblast

但是如果大量高变基因是：

MALAT1
NEAT1
XIST
GAS5

那么PCA可能部分反映：

RNA processing
stress
cell cycle
sex chromosome
transcriptional state

而不是：

cell identity

于是：

Cluster存在，但Cluster ≠ biological cell type。

六、一个典型例子：XIST

假设研究的是：

女性肿瘤样本

XIST可能非常明显。

如果：

XIST

进入HVG/PCA：

XIST high
     ↓
PC loading
     ↓
PCA separation
     ↓
Cluster separation

最后可能出现：

Cluster 1
XIST high

Cluster 2
XIST low

但这两个cluster：

可能并不是两个新的细胞亚群。

而只是：

XIST表达状态不同。

因此：

$\boxed{ Statistical\ cluster \neq Biological\ subtype }$

七、第四个问题：非编码基因会影响细胞注释

这是“看着基因中位数很高，但是注释不出来”。

可以把原因总结成：

高 nFeature
      ↓
并不代表
      ↓
高 annotation information

例如：

Cell A

3500 genes
↓
其中：
MALAT1
NEAT1
GAS5
RPLP0
RPS...
MT...
大量lncRNA

但是：

CD3D      0
CD3E      0
TRBC1     0
MS4A1     0
LYZ       0
EPCAM     0
COL1A1    0

结果：

这个细胞“基因很多”，但没有足够的cell identity marker。

最终：

Unknown
Unassigned
Ambiguous

或者被错误分配。

八、第五个问题：相近细胞类型更容易发生误注释

非编码基因本身通常不能很好地解决：

Macrophage
       ↕
Monocyte

DC
       ↕
Macrophage

CAF
       ↕
Pericyte

CD4 T
       ↕
CD8 T

例如：

Macrophage
LYZ
LST1
FCER1G
CTSS
C1QC
APOE

如果真正有区分能力的marker没有被稳定检测：

C1QC  low
APOE  low
FCER1G low

而非编码RNA占据大量表达特征：

MALAT1
NEAT1
GAS5

就容易出现：

cell identity signal弱，generic RNA signal强。

九、第六个问题：细胞亚群识别会受到影响

这是比“注释”更进一步的问题。

例如：

CD8 T cell

之后希望进一步分成：

Naive
Effector
Exhausted
Proliferative
Memory

理想marker：

TCF7
CCR7
IL7R
LST1
GZMB
GNLY
PDCD1
TIGIT
LAG3
TOX
MKI67

如果这些真正有生物学意义的marker检测不足，而：

MALAT1
NEAT1
GAS5

等占据较大权重，就可能出现：

Cluster A
Cluster B
Cluster C

但是：

这些cluster不一定对应真实的功能亚群。

所以：

$\boxed{ Subcluster\ number \neq Biological\ subtype\ number }$

十、对传统scRNA-seq的影响尤其要注意

传统scRNA-seq有一个优势：

通常接近全转录组检测。

所以：

Protein-coding
+
lncRNA
+
pseudogene
+
其他transcripts

都可能进入矩阵。

这意味着：

优点

非编码RNA可能提供：

发育状态
转录调控
应激状态
肿瘤状态
性别相关信息
染色质/转录程序信息

但是缺点

如果直接把所有feature：

全部Normalize
↓
全部HVG
↓
全部PCA
↓
全部Clustering

可能导致：

细胞类型信息和状态信息混在一起。

十一、因此scRNA-seq最好把“identity”和“state”分开

推荐思路：

RNA expression
       ↓
 ┌─────┴─────┐
 ↓           ↓
Identity     State
 ↓           ↓
CD3D         IFN
MS4A1        Stress
LYZ          Cell cycle
EPCAM        Hypoxia
COL1A1       EMT

也就是说：

第一层

确定：

这个是什么细胞？

第二层

确定：

这个细胞处于什么状态？

而不能：

所有gene
 ↓
PCA
 ↓
Cluster
 ↓
直接定义subtype

十二、对Stereo-seq的影响

Stereo-seq和scRNA-seq相比，最大的区别是：

多了空间信息。

所以非编码基因的问题不会消失，反而会进一步影响：

Gene expression
 ↓
Cell/bin annotation
 ↓
Spatial neighborhood
 ↓
Niche

十三、Stereo-seq第一个问题：高分辨率不等于高注释准确度

Stereo-seq可以提供非常高的空间分辨率。

但：

$\boxed{ Spatial\ resolution \neq Biological\ resolution }$

也就是说：

空间坐标非常精确

不代表：

每一个空间单位的cell identity都准确

仍然需要：

gene expression
+
cell segmentation
+
cell annotation

共同确定。

十四、Stereo-seq中的非编码基因会影响bin/cell的有效信息判断

例如：

Bin A
200 genes

看起来不错。

但如果：

MALAT1
NEAT1
GAS5
RPL
RPS

占据大量特征：

真正的：

CD3D
CD3E
TRBC
LYZ
COL1A1
EPCAM

很少。

那么：

这个bin虽然“gene number高”，但是cell identity information并不高。

十五、Stereo-seq特别容易遇到“空间信号很好看，但是细胞身份不够可靠”

这是空间数据与scRNA最大的区别之一。

可能看到：

Spatial map

红色区域
蓝色区域
绿色区域

图非常漂亮。

但是：

颜色的来源可能只是某几个高表达gene，而不一定代表真正的细胞亚群。

因此：

$\boxed{ Spatial\ pattern \neq Cellular\ mechanism }$

十六、Visium HD也是同样的问题

Visium HD最大的优势是：

比传统Visium具有更高空间分辨率。

但它仍然需要解决：

bin
 ↓
cell segmentation / cell assignment
 ↓
cell type annotation

因此：

高分辨率bin不等于天然获得准确单细胞。

十七、Visium HD中特别容易出现一个问题：一个细胞可能包含多个bin

例如：

       Cell
 ┌─────────────┐
 │ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪  │
 │ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪  │
 │ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪  │
 └─────────────┘

这些bin：

Bin 1
Bin 2
Bin 3
...

都可能属于同一个细胞。

所以：

gene detected/bin

不能简单理解为：

gene detected/cell

十八、因此Visium HD的“Median genes/bin”尤其不能直接作为细胞质量指标

这是非常重要的。

应该区分：

$Genes/bin$

和：

$Genes/cell$

如果经过cell segmentation：

多个bin
 ↓
一个cell

才可以进一步讨论：

genes/cell
UMI/cell
marker/cell

否则容易出现：

用bin级QC去解释细胞级生物学。

十九、非编码基因会进一步影响Stereo-seq / Visium HD的空间亚群分析

例如研究：

Tumor cells是否存在两个空间亚群？

需要做：

Tumor cells
 ↓
subcluster
 ↓
Tumor subtype 1
Tumor subtype 2

但如果驱动差异的是：

MALAT1
NEAT1
XIST
H19

那么需要先判断：

这是新的肿瘤亚群？

还是：

不同的转录状态？

还是：

技术/测序深度差异？

还是：

空间区域造成的RNA组成差异？

二十、这会直接影响Spatial Niche分析

典型流程：

空间转录组
      ↓
Cell annotation
      ↓
Neighborhood
      ↓
Niche
      ↓
Niche-associated subtype

如果：

Cell annotation

本身受到非编码RNA和有效marker不足的影响：

那么：

错误annotation
      ↓
错误neighborhood
      ↓
错误niche

所以：

$\boxed{ Niche\ quality \leq Cell\ annotation\ quality }$

二十一、举一个非常典型的肿瘤例子

假设真实情况：

Tumor
+
CAF
+
Macrophage
+
T cell

但是：

CAF marker
COL1A1
COL1A2
DCN
LUM

检测比较弱。

同时：

MALAT1
NEAT1
GAS5

检测非常高。

那么：

Cell identity signal
        ↓
      较弱

Generic transcript signal
        ↓
      较强

最后可能：

CAF
 ↓
Unknown / Tumor-like

那么后面：

CAF-rich niche

自然也会被低估。

二十二、通讯分析会进一步受到影响

例如研究：

CAF → Tumor

典型：

CAF
COL1A1
TGFB1
FGF
CXCL
     ↓
Tumor
TGFBR
FGFR
CXCR

但如果：

ligand

或者：

receptor

表达很低：

或者没有稳定检测：

就可能得到：

False negative

反过来，如果邻近细胞RNA存在：

spillover
ambient RNA
assignment error

又可能产生：

False positive

所以：

$\boxed{ Spatial\ LR\ inference = Candidate\ communication }$

而不是：

$\boxed{ RNA\ expression = Actual\ communication }$

二十三、非编码基因对CellChat / CellPhoneDB的一个特殊影响

经典的：

CellChat
CellPhoneDB
LIANA

主要围绕：

Ligand–Receptor

进行分析。

因此很多：

lncRNA
miRNA
pseudogene

不会直接进入传统的LR数据库。

这会造成：

非编码RNA
 ↓
调控ligand/receptor
 ↓
改变细胞通讯

但是：

CellChat
 ↓
看不到这一层

因此会形成：

通讯网络的调控层缺失。

二十四、这意味着非编码RNA会造成“通讯机制解释不完整”

真实机制可能：

lncRNA
 ↓
转录因子
 ↓
Ligand
 ↓
secretion
 ↓
Receptor
 ↓
downstream pathway

而CellChat可能分析：

Ligand
 ↓
Receptor

所以：

CellChat更适合提出通讯候选关系，而不是完整解释调控机制。

二十五、非编码RNA对三类数据的影响可以这样概括

① scRNA-seq

核心问题：

ncRNA
 ↓
HVG
 ↓
PCA
 ↓
Clustering
 ↓
Annotation

主要影响：

QC判断
HVG
PCA
clustering
cell annotation
cell state
subcluster

② Stereo-seq

在上述基础上增加：

空间定位
 ↓
cell/bin annotation
 ↓
neighborhood
 ↓
niche

因此影响：

spatial clustering
cell type mapping
spatial domains
neighborhood
niche
spatially variable genes

③ Visium HD

除了上述问题，还要特别注意：

bin
 ↓
cell

的转换。

所以影响：

bin-level QC
cell segmentation
cell calling
annotation
spatial domain
neighborhood
niche
communication

二十六、三者可以形成一个非常清楚的误差传递链

scRNA-seq

非编码RNA
     ↓
有效基因比例
     ↓
HVG
     ↓
PCA
     ↓
Cluster
     ↓
Annotation
     ↓
Cell state

Stereo-seq

非编码RNA
     ↓
有效空间特征
     ↓
Bin/Cell annotation
     ↓
Spatial domain
     ↓
Neighborhood
     ↓
Niche
     ↓
Communication

Visium HD

非编码RNA
     ↓
Bin-level signal
     ↓
Cell reconstruction
     ↓
Cell annotation
     ↓
Spatial neighborhood
     ↓
Niche
     ↓
Communication

二十七、因此不要只看这几个传统QC指标

很多分析报告只给：

nCount
nFeature
MT%

实际上不够。

我更建议增加：

① Protein-coding genes

$N_{PC}$

② Non-coding genes

$N_{NC}$

③ Ribosomal genes

$N_{Ribo}$

④ Mitochondrial genes

$N_{MT}$

⑤ Cell-type marker genes

$N_{Marker}$

⑥ Annotation confidence

⑦ Unknown / unassigned proportion

⑧ Major cell type detection rate

例如：

CD3D detected in 78% T cells
MS4A1 detected in 65% B cells
LYZ detected in 82% macrophages
COL1A1 detected in 91% CAF

这些指标其实比单纯：

Median genes/cell = 3000

更有解释价值。

二十八、可以定义一个非常重要的概念：有效信息率

虽然不是统一的标准指标，但在实际项目QC中非常值得使用。

例如：

$Effective\ Information\ Rate = \frac{Informative\ genes} {Total\ detected\ genes}$

例如：

样本A

$\frac{300}{3000}=10\%$

样本B

$\frac{500}{2500}=20\%$

那么虽然：

A = 3000 genes
B = 2500 genes

但是：

B可能拥有更高的有效细胞身份信息。

二十九、最终应该形成一个“有效信息金字塔”

比较推荐用下面这个框架：

                 ┌───────────────┐
                 │   Causality   │
                 │     因果      │
                 └───────▲───────┘
                         │
                 ┌───────┴───────┐
                 │ Communication │
                 │     通讯       │
                 └───────▲───────┘
                         │
                 ┌───────┴───────┐
                 │     Niche     │
                 │   微环境亚群   │
                 └───────▲───────┘
                         │
                 ┌───────┴───────┐
                 │ Neighborhood  │
                 │    邻域关系    │
                 └───────▲───────┘
                         │
                 ┌───────┴───────┐
                 │ Cell subtype  │
                 │    细胞亚群    │
                 └───────▲───────┘
                         │
                 ┌───────┴───────┐
                 │ Cell annotation│
                 │    细胞注释    │
                 └───────▲───────┘
                         │
                 ┌───────┴───────┐
                 │ Effective RNA │
                 │   有效RNA      │
                 └───────▲───────┘
                         │
                 ┌───────┴───────┐
                 │ Detected RNA  │
                 │   检测RNA      │
                 └───────────────┘

最底层的：

Detected RNA

并不能自动保证最上面的：

Causality

三十、最后总结

非编码基因对单细胞与空间转录组分析的主要影响

分析环节	主要问题	可能后果
QC	非编码RNA增加gene count	基因中位数虚高
有效信息	ncRNA不一定具有cell identity信息	有效基因比例下降
HVG	ncRNA进入高变基因	PCA受非身份信号影响
PCA	generic/states signal增强	细胞类型分离受影响
Clustering	非编码RNA参与聚类	产生非生物学cluster
Annotation	identity marker不足	注释困难/Unknown增加
Subtype	精细marker不足	亚群区分能力下降
Rare cells	marker稀疏	稀有细胞容易丢失
Stereo-seq	空间高分辨率但identity不足	空间图漂亮但注释不可靠
Visium HD	bin ≠ cell	bin级信号不能直接等同细胞信号
Spatial domain	非编码RNA形成空间差异	可能出现假空间pattern
Neighborhood	annotation误差传递	邻域组成偏差
Niche	cell type错误	错误空间微环境
Communication	ligand/receptor检测不足	False negative
Spillover	邻近RNA错误归属	False positive
LR数据库	ncRNA通常不在传统LR数据库	通讯机制不完整
机制解释	RNA ≠ protein ≠ activation	过度解释

最终一句话

对于 scRNA-seq、Stereo-seq和Visium HD，分析非编码基因时最需要避免的误区是：

$\boxed{ \text{“检测到的基因多”} \neq \text{“有效信息多”} }$

进一步：

$\boxed{ \text{有效信息多} \neq \text{细胞注释一定准确} }$

最终：

$\boxed{ \text{注释准确} \neq \text{空间Niche一定准确} \neq \text{通讯一定真实} }$

所以，非编码基因最大的分析影响不是简单的“它们没用”，而是会改变对数据质量、有效信息量和下游生物学结论的判断。

尤其是针对 Stereo-seq / Visium HD 空间微环境分析，最应该建立的思维是：

不要用“Median genes/cell（或 genes/bin）高不高”评价数据是否适合做细胞亚群和niche分析，而应该进一步判断：真正能够定义细胞身份和细胞状态的marker是否被稳定、特异地检测到了。

如果要进一步做严谨的数据分析，下一步就应该把这个框架落到 Seurat/Scanpy 的具体流程上：例如哪些 MALAT1/NEAT1/XIST/GAS5/RPL/RPS/MT 应该在 QC、HVG、PCA、annotation、niche 分析的哪个阶段处理，以及 scRNA、Stereo-seq、Visium HD分别应该怎么过滤非编码基因。

非编码基因（主要是lncRNA）对单细胞、stereo-seq、visium HD分析上的影响

作者，Evil Genius

生化小课，CADD计算机辅助药物设计已经开启，对分子对接/分子动力学感兴趣的同学可以报名参加，我自己做了个合集，在分子动力学，感兴趣可以关注一下。

在我们的2026年空间转录组系列课程中专门全系列讲解了visium 、visium HD、xenium、CosMx的数据分析，感兴趣可以看一下。

这一篇我们来总结非编码基因（主要是lncRNA）对单细胞、stereo-seq、visium HD分析上的影响。

现在大家拿到单细胞、stereo-seq、visium HD的基础分析报告，看着指标都挺好，实际上相比于原来添加了很多非编码基因，真正可以用的没有基础报告写的那么多。

一、先明确：什么叫“非编码基因”？

二、最重要的认识：检测到的基因 ≠ 有效的生物学信息

三、非编码基因对QC的第一个影响：造成“基因数量虚高”

Dataset A

Dataset B

四、第二个影响：非编码基因可能成为高变基因

五、第三个问题：聚类可能更多反映“RNA表达程序”，而不是细胞类型

六、一个典型例子：XIST

七、第四个问题：非编码基因会影响细胞注释

八、第五个问题：相近细胞类型更容易发生误注释

九、第六个问题：细胞亚群识别会受到影响

十、对传统scRNA-seq的影响尤其要注意

优点

但是缺点

十一、因此scRNA-seq最好把“identity”和“state”分开

第一层

第二层

十二、对Stereo-seq的影响

十三、Stereo-seq第一个问题：高分辨率不等于高注释准确度

十四、Stereo-seq中的非编码基因会影响bin/cell的有效信息判断

十五、Stereo-seq特别容易遇到“空间信号很好看，但是细胞身份不够可靠”

十六、Visium HD也是同样的问题

十七、Visium HD中特别容易出现一个问题：一个细胞可能包含多个bin

十八、因此Visium HD的“Median genes/bin”尤其不能直接作为细胞质量指标

十九、非编码基因会进一步影响Stereo-seq / Visium HD的空间亚群分析

二十、这会直接影响Spatial Niche分析

二十一、举一个非常典型的肿瘤例子

二十二、通讯分析会进一步受到影响

二十三、非编码基因对CellChat / CellPhoneDB的一个特殊影响

二十四、这意味着非编码RNA会造成“通讯机制解释不完整”

二十五、非编码RNA对三类数据的影响可以这样概括

① scRNA-seq

② Stereo-seq

③ Visium HD

二十六、三者可以形成一个非常清楚的误差传递链

scRNA-seq

Stereo-seq

Visium HD

二十七、因此不要只看这几个传统QC指标

① Protein-coding genes

② Non-coding genes

③ Ribosomal genes

④ Mitochondrial genes

⑤ Cell-type marker genes

⑥ Annotation confidence

⑦ Unknown / unassigned proportion

⑧ Major cell type detection rate

二十八、可以定义一个非常重要的概念：有效信息率

样本A

样本B

二十九、最终应该形成一个“有效信息金字塔”

三十、最后总结

非编码基因对单细胞与空间转录组分析的主要影响

最终一句话

生活很好，有你更好。

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