操作步骤:
1. 请自行准备:无水乙醇、异丙醇、1.5mL 离心管,无 RNA 酶生理盐水。
2. 取出洗涤液,按终浓度 70%比例加入无水乙醇, 9mL 加入 21mL 无水乙醇,18mL 加入 42mL 无水乙醇,混匀。
3. 取 10-20mg 左右的组织,用液氮研磨为粉末,转入无 RNA 酶的 1.5mL 离心管内,加入 100 μL 无 RNA 酶生理盐水,振荡 15 秒 ,加入 200 μL 裂解液, 20 μL 复合消化液,充分混匀,65℃温育 12 分钟(如组织匀浆不充分,可适当延长消化时间至无肉眼可见组织块)。
4. 加入 400μL 异丙醇,手振混匀,如有半透明悬浮物,不影响 RNA 的提取与后续实验。
5. 将吸附柱放入收集管内,将上述溶液转入吸附柱内,12,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液。
6. (可选步骤,去除 DNA) 取 RNase-free 离心管 1 只,每份需去除 DNA 的提取样本分别加入 10x DNase I Buffer 6μL、RNase-free ddH2O52μL 、RNase-free DNase I 2μL,轻轻手振混匀,勿剧烈震荡。用移液器在每份提取样本的吸附膜中央加入 60μL 上述配制好的 DNase I反应液,室温放置 15min,参见 BIOG RNase-free DNase I 试剂盒,货号:51004。
7. 按每份样本 40μL 取洗脱液(如 10 份提取样本,即取 400μL 洗脱液),放置于灭菌 1.5mL 离心管,65℃预热。
8. 将吸附柱放回收集管内,加 500μL 洗涤液至吸附柱内,静置 2 分钟,12,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液。
9. 将吸附柱放回收集管内,加 500μL 洗涤液至吸附柱内,12,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液。
10. 将吸附柱放回收集管内,12,000 rpm 离心 2 分钟,离去残留的洗涤液。
11. 取出吸附柱,放入新的 1.5 mL 离心管内,加入 40 μL 洗脱液,静置 2 分钟,12,000 rpm 离心 1 分钟,收集 RNA 溶液。提取的 RNA 即可用于下一步实验或-70℃保存。
注意事项:
1. 组织在提取前应匀浆充分,如无法充分匀浆,应延长消化时间至组织完全消化,直至肉眼无可见的组织块 。
2. 裂解液 含有刺激性化学物质 ,操作过程请做好防护措施,避免直接接触皮肤,防止吸入口鼻。
3. 洗涤液在使用前应加入乙醇后充分混匀, 最好现用现配,每次根据所需提取的样本量计算后适量配制。
4. 由于 RNA 容易降解,提取实验所用器具应除去 RNA 酶,实验过程中最好戴一次性洁净手套、口罩,提取的 RNA 溶液可适当加入 RNA保护因子(货号:51090,一般 50μLRNA 溶液加入 2μL。)