hello，大家好，又是周六，该死的加班，不过也好，分享一点新的东西，就是10X空间转录组在植物研究方面的运用，其实无论是10X单细胞、10X空间转录组，都曾寄希望于植物的研究，单细胞前景仍然不是很明朗，我们来看看空间有怎么样的发挥吧。

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今天分享的文章在Title: Spatial resolution of an integrated C₄+CAM photosynthetic metabolism，很好的文章，具有启发性。

Summary

在过去的 3000 万年里，C₄ 和 CAM 光合作用在植物中反复进化。 由于两者都重新利用了同一组酶，但它们的空间和时间部署不同，因此长期以来一直认为它们是distinct and incompatible adaptations。 值得注意的是，含有多种 C₄ 物种，可在干旱时执行 CAM。 基因表达的空间显式分析显示 C₄ 和 CAM 系统完全整合到 中，CAM 和 C₄ 碳固定发生在相同的细胞中，CAM 生成的代谢物可能直接并入 C₄ 循环。 Flux balance分析证实了基因表达并预测了干旱条件下的综合 C₄+CAM 系统。 C₄+CAM 光合代谢的首次空间明确描述为作物改良提供了新的蓝图。

Introduction

C₄ 和 CAM 光合作用是陆生植物中多次进化的两种重要适应性。 这些适应性使植物能够在不利条件下维持或增加其自养核心碳代谢。 两者都充当碳浓缩机制 ()，减轻光呼吸引起的能量损失，当大气 CO₂ 水平低、内部叶片温度高或植物气孔导度降低（例如，由于水分胁迫）时，就会发生这种情况。两种 都重新利用了一组共享的核心代谢酶，这些酶存在于所有植物中，但它们在如何分离和创造围绕 Rubisco 的富含二氧化碳的环境方面有所不同，这种酶通过卡尔文循环将大气中的二氧化碳固定为糖类。 在 C₄代谢中，PEP 羧化酶 (PEPC) 首先与叶肉细胞中溶解的 CO₂ 相互作用，形成临时的 4 碳分子，通常是苹果酸或天冬氨酸。 然后这些分子被运输到内束鞘细胞，在那里 Rubisco 被限制，脱羧并以高速率释放 CO₂，使 Rubisco 饱和。 在那里，二氧化碳进入卡尔文循环并被同化为碳水化合物。因此，C₄ 本质上是一个时间同步的双细胞光合作用系统，PEPC 和 Rubisco 具有单独的隔室，导致 C₄ 植物实现最高的光合作用速率。在 CAM 植物中，气孔开放和 PEPC 固定 CO₂ 发生在夜间。 4-碳苹果酸在叶肉细胞液泡中以苹果酸的形式储存过夜。 在气孔关闭的白天，苹果酸离开液泡进行脱羧，二氧化碳在同一细胞中被卡尔文循环释放和同化。因此，CAM 是一个时间上异步的单细胞光合作用系统，PEPC 的初始碳捕获发生在夜间，但最终的 Rubisco 同化和碳水化合物产生发生在同一细胞中的白天。 CAM 倒置的气孔行为通过避免在白天最热的时间通过气孔流失水分来提高用水效率。CAM 表达的程度也存在显著差异：许多物种使用 CAM 作为其主要代谢，但可能更常见的是兼性 CAM 系统，其中植物运行 C₃ 代谢，但表现出兼性 CAM 作为应激反应。 两种 都表现出显著的进化收敛性。 C₄ 已经进化了至少 60 次，C₄ 物种包括地球上一些生产力最高的植物，占陆地初级生产力总量的 30% 以上，包括玉米和高粱等几种基本作物。 虽然 CAM 起源的数量鲜为人知，但据推测它高于 C₄，并且某种形式的 CAM 代谢在各种生态系统中占主导地位。

尽管 C₄ 和 CAM 有大量的独立起源，但在大多数情况下，植物谱系倾向于进化出一种 或另一种。 40 多年前， 被确定为第一个已知的 C₄ 植物，它也响应干旱或光周期运行兼性 CAM 循环 (C₄+CAM)。 C₄ 和 CAM 循环的完全整合，即两者都在同一群光合叶肉细胞中运行，在多个方面似乎是难以置信的：1) 共享的一组酶需要在一天的不同时间和不同的细胞中表达，从而产生显著的监管冲突； 2）白天在同一叶肉细胞中Rubisco（用于CAM）和PEPC（用于C₄）的活性将导致对CO₂和代谢循环的无效竞争； 3) 优化每个 的解剖学要求是不同的并且可能是拮抗的，因为 CAM 需要大的叶肉细胞体积，而 C₄ 需要高的束鞘与叶肉体积比； 4) 适应本身在生态上具有潜在的对抗性，因为 CAM 的好处主要是提高用水效率，而 C₄ 植物利用强光和季节性可用水来实现快速生长和高生产力。只有少数免疫定位研究追求 中 C₄+CAM 的空间分辨率，由于缺乏 C₄ 特异性与 CAM 特异性分子标记，结果是模棱两可的。 无论如何，最被接受的假设是 CAM 和 C₄ 循环在中独立运行，C₄ 在束鞘和叶肉细胞中，CAM 在专门的储水细胞中。 只提出了一种可能的整合——从 CAM 产生的苹果酸理论上可以在 C₄ 束鞘中处理。

最近的基因组信息为解析 C₄ 和 CAM 反应的空间构型提供了机会。多项研究现已鉴定出 PEPC 的 C₄ 和 CAM 特异性同源物以及一些伴随的 附属酶，为鉴定发生 CAM 和 C₄ CO₂ 固定的细胞群提供了关键标记。值得注意的是，多种 物种中 CAM 脱羧基因的不同同源物缺乏显著上调，这表明 C₄ 和 CAM 生物化学的某些元素可能是共享的。然而，这些分析是在全叶转录组上进行的，缺乏识别 C₄ 和 CAM 过程发生位置所需的空间分辨率。我们在分离叶肉和束鞘细胞群的充足浇水和干旱条件下对 叶子进行了两种不同的空间显性基因表达分析。此外，我们利用基于约束的建模来专门测试在各种情况下跨叶肉和束鞘细胞的 C₄ 和 CAM 整合的最有效生化模型。我们一起将 的这些分析作为对植物光合代谢的首次描述。

Results

Assessment of CAM induction

在 7 小时和 19 小时对浇水良好的叶进行的可滴定酸度分析并未导致一夜之间酸的显著积累（两样本 t 检验，p = 0.62，t = -0.33，df = 5.95)。 这证实了在充分浇水的条件下，CAM 活性很少或没有积累苹果酸。 在总停水 7 天后，与光周期结束时收集的叶子相比，在清晨收集的叶子中检测到显著的酸积累（t 检验，p = 0.00032，t = 7.34，df = 5.17)，确认 CAM 感应。

LMD-RNA Sequencing and read alignments

为了获得细胞特异性基因表达，我们从充分浇水和干燥的叶子制作副切片，并使用激光显微切割 (LCM) 捕获叶肉和束鞘细胞组。

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• 注：Drought induction of CAM and laser capture microdissection. (A) Diel fluctuation of titratable acidity from whole leaves of well-watered plants and after a 7-day drought treatment. (B) oleracea, illustrating the orientation of paradermal sections (blue box). (C) Fresh, flash-frozen paradermal leaf section in cryosection block; red square indicates an area used for tissue dissection. (D) Microphotograph of a 12um thick leaf paradermal section indicating bundle sheath (BS) and mesophyll (M) tissues before (D), and after (E), BS cell capture. Orange arrows in (D) indicate calcium oxalate crystals in M cells. The red line in (E) indicates a laser-cut area of BS tissue, and the orange line illustrates an area of M tissue for laser capture. (F) RNA profile by electrophoresis for quality control. CP: Chloroplast RNAs.

从每个组织的群体中分离出 mRNA 以进行短读长测序。 对代表 10.5 亿个 100 bp 双端reads的 28 个library进行了测序，每个library的平均reads为 3749 万（SD = 385 万）个。 经过QC和trim后，平均保留了 68.97% 的reads。 从 Gilman 等人检索到的 P. oleracea Trinity 组装转录组。 (2021) 由 444307 个configs和 230895 个 Trinity “unigenes”组成。 译码器预测了 152530 个configs中的编码序列，CDHIT 将冗余configs减少到 37518 个“unigenes”中的最终 54241 个configs。

mRNA contigs 的简化数据集代表 83.20 Mbp 和 2101 bp N50。 Kallisto mapping到减少的 P. oleracea mRNA contigs 组的平均reads为每个library的 75.30% (SD = 3.65%)，平均 59.96% (SD = 3.48%) 的mapped reads具有独特的比对。 mapping到 和淀粉代谢相关基因家族的reads占白天叶肉细胞库的 10.97% (SD = 2.49%) 和白天束鞘细胞库的 12.18% (SD = 2.94%)。 平均而言，夜间library中 5.20% (SD = 1.83%) 的mapped reads到 相关基因，而白天library中 11.62% (SD = 2.70%) mapped reads到 相关基因。

Global transcriptional differences across experimental variables

转录组范围内基因表达的多维标度分别沿维度 1 和 2 聚集时间点和组织复制 (n >= 3)。 MDS 进一步按每个时间和组织簇内的水状态分离样品。 在通过低读取mapping过滤器的 22509 个 unigenes 中，2702 个（12.00%）在 M 和 BS 之间差异表达（DE）（padj < 0.05）。 其中，1030 (38.12%) 在 M 中表达更高，1672 (61.88%) 在 BS 中表达更高。 1196 个 unigenes (5.31%) 在浇水处理中显著的 DE； 其中，745 种（62.29%）在浇水充足的植物中更为丰富，451 种（37.71%）在干旱期间更为丰富。 我们在各个时间点发现了 7513 个 DE unigenes (33.37%)，分别在白天和夜间分别有 3553 个 (47.29%) 和 3960 个 (52.71%)。

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• 注：Transcriptome-wide gene expression patterns across mesophyll and bundle sheath samples. (A) All LMD samples projected into the first two dimensions of a transcriptome-wide multidimensional scaling analysis of log-transformed expression. Treatments: D, drought. WW, well-watered. (B) Venn diagram with number of differentially expressed genes across variables.

使用所有样本，基因差异表达分析显示，大多数检测到的基因表达变化发生在白天和黑夜之间，其次是细胞类型和水分状态。 差异表达基因的基因本体 (GO) 分析显示非光合碳捕获 GO 项（碳利用 GO:0015976）的叶肉富集，而卡尔文循环 (GO:0019253) 和光呼吸项 (GO:0019264, GO:0009853) 富集在束鞘细胞中。 干旱条件下上调的基因在胁迫响应 GO terms中富集，作为对盐和脱落酸的响应 (GO:0009651;GO:0009737)，而在良好浇水时表达更高的基因在光合作用和碳利用相关terms中富集 (GO:0009768;GO :0015976) 。

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Transcriptional changes in -related genes across cell types

在 中注释了 629 个具有已知或假设功能的三位一体 unigenes，包括淀粉代谢、昼夜节律和相关的转录因子。对于大多数核心 酶，unigenes 被注释为 eudicot 基因谱系，如果可用，eudicot 基因谱系命名法在基因名称后跟一个破折号表示。 过滤低丰度unigenes后保留480个unigenes； 其中，170 个 (35.42%) 是跨细胞类型的 DE，其中 83 个 (48.82%) 在束鞘中更丰富，87 个 (51.18%) 在叶肉中更丰富。 我们发现 307 (63.05%) 个 相关的 unigenes 随着时间的推移是 DE，其中 230 (74.92%) 在 7 小时更丰富，77 (25.08%) 在 23 小时更丰富（附加表 S12）。 最后，75 (14.79%) 个 相关的 unigenes 是跨水方案的 DE，其中 61 (81.33%) 在浇水良好的植物中更丰富，10 (13.33%) 在干旱植物中更丰富。

C₄ 相关基因的差异表达分析与 C₄ 叶肉与束鞘表达的预期一致。 在浇水充足和干旱的植物中，最初的 C₄ 碳固定模块发生在叶肉细胞（叶肉与束鞘； MvsB log2FC > 1.5；Padj < 0.01；Module 1）。 确定了第二个束鞘特异性 (MvsB log2FC = -1.31; Padj < 0.01) ASPAT 同源物 (ASPAT-1E1) 作为候选基因，代表 C₄ 代谢物进入包含苹果酸的束鞘中的 CO₂ 脱羧/同化模块的入口点酶（NADME-2E）和卡尔文循环（MvsB log2FC > -1.4; Padj < 0.01; Module 2）。

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• 注：Differential gene expression of mesophyll and bundle sheath across experimental conditions. (A) Schematic of C₄, CAM, and accessory biochemical pathways; solid and dotted lines indicate C₄ and CAM routes of carbon concentration, respectively, the gray box contains night reactions, and key substrates are shown (Abbreviations: PEP, phosphoenolpyruvate). Intracellular compartments are indicated within red boxes (Abbreviations: V, vacuole; C, chloroplast). (B) Differential transcript abundance (measured in log2 fold change, log2FC) of selected genes in mesophyll (M) relative to bundle sheath (BS) tissue (left panel) and at 07h relative to 23h (center panel) across LMD samples. Gene colour backgrounds reflect pathways in (A). In the third panel, white triangles indicate log2FC of 7h mesophyll samples in drought:D relative to 7h mesophyll samples well-watered:WW. Black triangles indicate log2FC of 23h mesophyll samples in drought compared to 23h mesophyll samples well-watered. A triangle in the WW region (negative log2FC, left to the red line) indicates higher expression during WW, while triangles within the D region (right to the red line) indicate higher expression in D. In all panels, asterisks indicate differential expression significance (Padj < 0.05).

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我们发现了两种具有 C₄ 样表达的苹果酸酶 (ME)，例如，偏向于早晨并仅限于 BS 细胞。 除了用于 C₄ 酸脱羧（线粒体苹果酸酶 NADME-2E）的主要 P.oleracea ME 外，我们还发现了一种叶绿体 ME（NADP-ME-1E1b），它可能表明辅助脱羧途径。

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• 注：Transcription abundance of selected -related genes. Median of transcripts per million (TPM, y-axis), across time points (7h and 23h, x-axis) in LMD mRNA libraries. Black and red lines indicate mesophyll or bundle sheath samples, respectively. Plain lines indicate watered and dotted indicate drought. Error bars represent the interquartile range of expression.

然而，之前的western blot分析显示，与 NAD-ME 相比，NADP-ME 的丰度较低，这表明 NADPME 活性可能是转录后调节的。 参与 PEP 再生的基因表达仅限于叶肉（MvsB log2FC > 1.4；Padj < 0.01；模块 3）。 在 相关基因中，光呼吸基因主要在束鞘中表达（模块 9），但叶绿素 Dperpetuity 甘油酸 3-激酶 (GLYK) 除外，该酶以前曾报道为叶肉特异性.

在充分浇水和干旱诱导的 C₄+CAM 中，核心 C₄ 循环基因的直向同源物身份和组织定位通常保持不变。 当 CAM 被诱导时，碳酸酐酶 (BCA-2)、PEP 羧化酶 (PEPC-1E1c) 和苹果酸脱氢酶 (NADMDH-6E1) 的不同同源物显著增加了它们的叶肉丰度（叶肉、干旱与充足浇水；M_DvsWW log2FC > 1.7；Padj < 0.01；)。 在叶肉中，与水分充足的白天样本相比，CAM 特异性旁系同源物 PEPC-1E1c 在干旱条件下的夜间表现出 5.6 log2FC，其丰度接近于零 (Padj < 0.01;)。 同时，PEPC 激活蛋白 PEPC 激酶 (PPCK-1E) 在干旱样品中的夜间丰度增加（M_DvsWW log2FC > 2.3；Padj < 0.01；） 。

据称，夜间产生的苹果酸被铝激活的苹果酸转运蛋白 (ALMT-12E2) 主动泵入液泡，该转运蛋白由液泡型质子 ATP 酶 (VHA) 产生的阳离子电流驱动，尽管在任何干旱期间都没有表现出增加的表达。 细胞类型（模块 8）。 然而，我们发现干旱样品（M_DvsWW log2FC = 3; Padj < 0.05, Module 0）中编码质膜质子泵 ATPase 10 (PMA10) 的基因急剧上调，仅限于叶肉（MvsBS log2FC = 2.9; Padj < 0.01 )，但 CAM 中的角色只是推测性的。 导致 CAM 中液泡苹果酸流出的机制仍然未知，但最合理的是液泡膜二羧酸转运蛋白 (TDT-1E)，其在干旱期间表达增加，特别是在叶肉中（M_DvsWW log2FC = 1.6；Padj < 0.01；模块 8）。

与 C₄ 植物不同，CAM 植物通常通过降解淀粉和糖来产生 PEP； 然而，我们的样本仅显示在 CAM 诱导期间淀粉和糖降解基因中淀粉质磷酸葡聚糖磷酸酶 DSP4（DSP_SEX4）的显著上调（模块 6 和 7）。 时间上，淀粉降解基因在夜间更为丰富（模块 7）。 在空间上，除了叶绿体果糖-二磷酸醛缩酶（FBA 基因家族，ALFP 谱系）外，大多数transitory starch-related genes（模块 6）在白天在叶肉中更丰富， 仅限于束鞘（MvsBS log2FC = 1.8; Padj < 0.01）。FBA 将 1,6-二磷酸果糖降解为 3-磷酸甘油醛 (G3P)，然后 G3P 在一系列糖酵解反应中进一步降解为 PEP，其编码基因主要表达 在白天的叶肉中（模块 6）。 液泡体和叶绿体糖转运蛋白对束鞘（模块 5）表现出最高的表达特异性，表明在 C₄ 和 C₄+CAM 植物的卡尔文循环中起作用。 其他糖转运蛋白，如 ERD6 样 (EDL16) 基因和叶肉限制性 SWEET13 也随着 CAM 诱导而大量增加（M_DvsWW log2FC > 5,8; Padj < 0.01;）。 我们的数据表明与 CAM 诱导相关的糖转运增加，G3P 起源于束鞘，但 PEP 再生的最终步骤主要发生在叶肉中。

我们还在 CAM 诱导的植物中发现了与夜间细胞壁结构相关的上调基因：叶肉中的 EXPA2 和 SAU32 和束鞘中的 NAP2。连同离子转运蛋白可能的镁转运蛋白 (NIPA7) 和质膜型 ATPase 10 (PMA10) 和束鞘特异性线粒体解偶联蛋白 4 (PUMP4) 的叶肉特异性上调，我们推测它们可能发挥CAM期间淀粉和糖跨细胞转运的调节作用。在 CAM 诱导过程中，一个参与束鞘液泡过程 (VPE1) 的基因在夜间也上调。 CAM 的夜间活动主要受与生物钟相关的转录因子 (TF) 的调节。我们检测到可能与 CAM 诱导和水分胁迫反应相关的 TF 的表达变化，包括叶肉中转录抑制因子 MYB4 和束鞘中苯乙醛还原酶 PAR1 的昼夜表达增加，以及两种细胞类型中转录因子 BH062 的昼夜丰度降低。在夜间，我们观察到 TFs 稻草人样蛋白 15 (SCL15)、蛋白核融合缺陷 4 (NFD4)、同源盒-亮氨酸拉链蛋白 ATHB7 和可能的 WRKY 转录因子 7 (WRKY7) 在两种细胞类型中的上调, 以及叶肉中的蛋白质光依赖性短下胚轴 3 (LSH3) 。

Visium spatial gene expression

为了确认 LMD 结果，我们使用 10x Genomics Visium 空间转录组学平台（10X Genomics；Pleasanton，CA）直接在叶旁切片上捕获和空间标记 mRNA。 总基因表达的 K 均值聚类分组对应于叶肉、束鞘和储水组织的区域。 在 LMD 分析中转录估计值低于 200 TPM 的基因在 Visium 文库中的代表性较差。 mapping到叶切片显微照片上的转录丰度显示 和卡尔文循环基因在储水组织中含量很低或未被检测到，包括 C₄ 和 CAM 特异性 PEPC 旁系同源物。 我们的 Visium 分析证实了浇水充足的样品中几乎没有 CAM PEPC-1E1c 表达，以及干旱样品中 C₄ 和 CAM PEPC 旁系同源物丰度的昼夜交替。 PEPC 主要限于叶肉，脱羧基因和 Rubisco 仅限于束鞘

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• 注：Visium spatial gene expression. (a) Microphotograph of a leaf paradermal section, K-means clustering of total gene expression, and abundance of the main C₄, CAM and Calvin cycle carboxylases using the 10x Genomics Visium platform. K-means clustering of sampling spots corresponds to bundle sheath (BS, dark blue), mesophyll (M, light blue), and water storage (WS, orange) tissues; abundances of PPC-1E1a’, PPC-1E1c, and RBCS are shown relative to their observed unique molecule index (UMI) ranges. (b) Violin plots of transcript abundance in UMI across sample spots classified by tissue type in 23:00 h samples.
  
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Flux balance model

为了进一步探索 C₄ 和 CAM 可能如何整合，我们构建了一个改编自高度策划的植物核心代谢模型的双细胞两相模型。核心代谢模型包括在广泛的植物基因组中被发现高度保守的所有主要代谢酶和反应，并代表了一个“核心”化学计量模型，它捕获了叶子中的中心碳代谢。我们的新模型代表了 C₄ 和 CAM 如何从一般植物代谢的第一原理以简约的方式集成。我们使用简约通量平衡分析 (pFBA) 来模拟可能的 C₄ 和 CAM 配置的效率。在我们的模型中，代谢通量受到每个反应消耗或产生代谢物的速率的限制，并将叶肉和束鞘细胞内的代谢通量视为不同的隔室。允许所有反应在两个细胞中和在任何时间发生。代谢模型中主要反应的预测通量与差异基因表达结果大多一致，大多数不一致在FVA的预测方差内。

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• 注：Correlations between predicted enzymatic fluxes and estimated gene expression in mesophyll and bundle sheath samples. Pearson correlation for individual enzymes between predicted reaction fluxes in the most efficient C₄+CAM flux balance model (FBA) and the expression (EXP) of their encoding genes as the mean of transcript abundance in the LMD samples (transcript per million, TPM). Each data point corresponds to an experimental group of samples composed of drought (D) or wet conditions (W), mesophyll (M) or bundle sheath (BS) tissue and daytime (7h) or night time (23h). Time labels are shown next to each point. Expression and flux balance results are normalized by maximal values for each enzyme/gene. Regression lines are shown in blue and standard errors in grey.

在水分充足的条件下，通量平衡模型预测了 C₄ 光合作用途径，束鞘中有少量 CAM 循环；在干旱条件下，该模型预测了 C₄+CAM 通路的出现。虽然该模型预测了典型的 C₄ 循环，但预测的 CAM 循环是使用大气和呼吸二氧化碳的跨叶肉和束鞘的双细胞循环，以及使用呼吸二氧化碳的束鞘中的规则单细胞循环。对于双细胞 CAM 循环，CO₂ 被 PEPC 同化，转化为苹果酸，并储存在叶肉液泡中。白天，苹果酸被转移到束鞘中并在其中脱羧，在那里完成 CC₃ 循环。所有基本的 C₄ 和 CAM 相关反应（PEP 羧化、碳酸酐酶活性、Rubisco 羧化、CO₂ 吸收、NAD-ME 活性和 PEP 双激酶调节）在 FVA 中几乎没有变化，表明它们是稳健的过程。大多数与代谢物周转相关的过程（即苹果酸、OAA、ALA、ASP、PYR）都非常灵活。尽管 pFBA 预测了具有最低通量总和的解决方案，但这些通量表现出很大的变化，而不会影响系统的效率。

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• 注：Biochemical flux results in the pFBA model of an integrated C₄+CAM photosynthesis. Schematic of major metabolic fluxes related to C₄ and CAM in the mesophyll (M) and bundle sheath (BS); orange and blue arrows indicate daytime and night-time reactions, respectively. Black numbers indicate fluxes under well-watered conditions (300 ppm internal CO₂ concentration at daytime, no limit for night-time); red numbers indicate fluxes under drought conditions (70 ppm CO₂ internal concentration at daytime. no limit for night-time). Minor fluxes are not shown for simplicity and therefore not all shown input and output fluxes are equal.

我们进一步研究了阻断细胞间苹果酸转移和苹果酸储存是否会影响 C₄+CAM 系统的效率。 在水分充足和干旱条件下，阻止苹果酸转移不会影响系统的效率，因为叶肉和束鞘之间的苹果酸、ASP 和 ALA 转移是可互换的，因此阻止一种代谢物诱导转化为替代代谢物以进行细胞间运动 . 此外，苹果酸转移可能在 C₄+CAM 系统中具有最小的酶促和代谢成本。 单独在叶肉或束鞘中阻止苹果酸的储存不会影响系统的效率； 然而，阻止叶肉和束鞘中苹果酸的储存会大大降低效率并引入不稳定性。 苹果酸储存是 C₄+CAM 代谢的必要条件，但苹果酸储存在叶肉或束鞘中并不重要。

总之，在充分浇水的条件下，pFBA 预测了 C₄ 通路，束鞘中只有非常少量的 CAM； 但在干旱条件下，pFBA 预测了 C₄+CAM 系统，与我们的基因表达结果一致。 在干旱条件下，与 C₄ 和 CAM 循环相互独立运行的模型相比，将来自 CAM 的苹果酸整合到 C₄ 循环中可以最大限度地提高韧皮部光合产物的产量，同时酶投入最少。 在集成模型中，大多数夜间二氧化碳固定发生在叶肉中，而苹果酸则储存在两个细胞的液泡中。 白天，来自叶肉液泡的苹果酸流量移动到束鞘进入 C₄ 脱羧模块。

Discussion

是一种罕见的 C₄ 物种，能够将 CAM 光合作用表达为对缺水的应激反应。 这种代谢灵活性允许 在资源充足时实现高光合作用，而且还能在相对较长的时间内耐受极端干旱，同时保持核心碳代谢，打破植物生理学的基本权衡。 先前的研究确定了与 C₄ 和 CAM 相关的候选酶，但是这两种途径在 叶子内的空间组织方式仍然未知。 我们比较了充分浇水和干旱诱导的 CAM 表达 植物，并利用空间基因表达分析的最新进展首次描述了一种将 C₄ 和 CAM 循环整合到单个代谢系统中的新型生化途径

Visium 空间基因表达分析证实，激光捕获的叶肉和束鞘组织显示 CAM 和 C₄ 在同一细胞中运行

传统上，通过原位杂交对不同组织中基因表达的空间描述必然限于少数基因。在这里，我们使用激光捕获显微切割估计了叶肉和束鞘细胞中数万个基因的表达。此外，使用 Visium (10X Genomics) 空间基因表达工作流程，我们绘制并可视化了 C₄和 CAM 相关基因在叶子的皮旁解剖切片上的表达。这种规模的空间基因表达分析在植物中仍然非常罕见，并且在解决植物分子生物学和功能中的各种问题方面具有非凡的前景。基于相似基因表达的 Kmeans 聚类，我们的 Visum 空间基因表达分析预测了样本中叶肉、束鞘和储水细胞覆盖的区域。重叠叶切片显微照片的基因表达图与激光捕获的细胞样本中的发现一致：与 C₄ 和 CAM PEPC 活性相关的基因在叶肉中更丰富，而脱羧和卡尔文循环基因偏向于束鞘。在存在储水细胞的区域，代谢活动显得非常低，几乎没有捕获到任何 相关基因的转录本。使用空间蛋白质组学和代谢组学分析的未来工作将对确认这些结果具有决定性意义。

一种新的光合作用途径：CAM 代谢通量与 C₄ 途径相连以进行脱羧

研究还建立了一个由高度策划的模型改编而来的双细胞双日植物代谢模型，并使用通量平衡分析 (FBA) 来测试 C₄ 和 CAM 可以运行的最有效的生化途径，并将结果与我们的转录本丰度估计。我们的新模型代表了基于一般植物代谢第一原理的 C₄ 和 CAM 的整合。该模型预测，与单独的纯 C₄相比，C₄+CAM 系统在干旱条件下的运行效率更高；然而，当干旱条件得到缓解时，纯 C₄ 系统比 C₄+CAM 具有更高的效率。这与观察到的 行为一致。其次，FBA 模型预测主要 C₄ 和卡尔文循环反应的细胞区室化与我们的表达数据一致，但需要注意的是，叶肉中 RuBisCO、NAD-MDH 和 NADME 的转录丰度高于模型预测的（尽管仍主要表达）在束鞘中）。这些结果可以部分解释为酶的不完全分离，或用于叶肉和束鞘分离的激光显微切割的不完美性质。第三，在干旱条件下，与没有整合循环的模型相比，将来自 CAM 的苹果酸整合和加工到 C₄ 循环中，以最少的酶成本使光合产物的韧皮部产量最大化。在这个模型下，大多数夜间二氧化碳固定发生在叶肉和束鞘中的一小部分，并储存在两个细胞的液泡中。白天，来自叶肉的苹果酸通量到达束鞘进入 C₄ 脱羧模块。总之，我们首次展示了在 P. oleracea 中运行的双细胞 CAM 系统，其中 CO₂ 由 C₄ 和 CAM 机制固定在相同的叶肉细胞中，但在不同的时间，苹果酸的 CAM 通量进入 C₄ 循环白天在束鞘细胞中脱羧，最后通过 Rubisco 和卡尔文循环同化为糖。

丰富的基因拷贝、祖先的多肉植物和不寻常的脉络结构使中 C₄+CAM 的进化成为可能

分析证实，P. oleracea 具有集成的 C₄+CAM 光合作用，其中初始 C₄和 CAM 碳固定在 24 小时内发生在相同的叶肉细胞中，脱羧和最终的 CO₂ 同化仅限于束鞘。只有一部分核心酶为 C₄ 与 CAM 表达募集了不同的同源物。因此，为防止这种协调而提出的监管限制似乎很容易克服；并非所有基因都需要基因表达的时间或空间变化，而那些只是利用替代同源物的基因。那么为什么 C₄ 和 CAM 的同时出现如此罕见，仅在 中发现，而最近， Trianthema 可能存在许多 C₄+CAM 物种但尚未确定，因为大多数已知的 C₄ 物种尚未被研究CAM 活动。同时，看看和 Trianthema 的共同点是有帮助的。两者都是轻度多汁植物，它们是主要具有 C₃+CAM 或 CAM 代谢的进化枝的不寻常 C₄ 成员。 的祖先是 C₃+CAM 物种，它多次平行进化 C₄，我们预测 Trianthema 将遵循类似的进化轨迹。通过进化出三维叶脉系统同时仍保持组织肉质，实现了高效 C₄光合作用所需的高束鞘：叶肉比率 - 从而克服了 C₄ 和 CAM 解剖学要求的潜在对抗。我们预测，与遗传或代谢协调相比，解剖学可能对 C₄+CAM 系统的出现施加更大的进化约束，并且我们更有可能在温和多汁的 C₄ 进化枝或与 CAM 密切相关的 C₄ 进化枝中找到额外的 C₄+CAM 物种-进化的谱系

A C₄+CAM metabolism and global food security

C₃ 植物中的兼性 CAM 循环有助于在压力（通常是干旱）期间保持正碳平衡。 与 C₄结合，兼性 CAM 循环提高了植物的耐旱性，还可以实现极高的光合作用速率，从根本上规避了限制植物功能的基本生产力-耐受性权衡。 未来的工作应该通过基因编辑实验性地确认中兼性 CAM 的好处。 非常适合作为光合作用研究的模型系统进行开发：它的生命周期短，自相容，并且已经可以获得高质量的 P. amilis 基因组

集成的 C₄+CAM 光合作用激发了未来作物改良和粮食安全的途径，因为全球正在进行一项将 C₄ 或 CAM 途径设计为 C₃ 作物的计划。 随着气候变暖，蒸散量增加的预测表明开发耐旱作物的紧迫性； 但在玉米中，数十年来对更健壮作物的选择导致了显著更高的干旱敏感性，因为玉米作为一种 C₄ 植物，已经具备在白天处理苹果酸以生产糖的能力，设计一个兼性 CAM 循环可能只需要少量完整的 C₃到 CAM 或 C₃ 到 C₄转换所需的更改。 C₄+CAM 玉米可以在全球范围内实现低投入、高产、carbon footprint更小的农业。

Method

Visium Spatial Gene Expression analysis

使用 Visium Spatial Gene Expression 平台从组织切片获得的reads使用 Space Ranger V1.1.0 (10X Genomics) 中实施的分析管道进行处理[https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/pipelines/latest/what-isspace-ranger]。使用‘spaceranger mkref’构建参考转录组，解析Transdecoder生成的外显子unigene信息和unigene最长同种型的序列。在可能的情况下，将reads mapping到每个 相关基因谱系或每个基因家族的最高表达的 unigene，来自上述 LCM 分析，总共 140 个序列。我们根据基准标记手动对齐明场显微照片，并选择捕获点覆盖组织的区域。然后我们运行“spaceranger count”来 triming reads并将它们与参考转录组对齐，使用默认参数。独特的分子标识符 (UMI) 后来被用来纠正和估计每个空间捕获点每个 unigene 对齐reads的计数。在 Space Ranger 中自动执行主成分分析 (PCA) 和通过表达相似性对斑点进行 K 均值聚类，并在 Loupe Browser 5.0（10X 基因组学）中进行可视化。

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