1. 提高转染效率
成功的转染是RNAi实验的前提。若基因沉默效果不佳，则需先排查转染效率方面的问题，可通过检测转染效率或者采用阳性对照siRNA验证RNAi实验体系。首先可依据转染试剂说明书进行转染条件（细胞密度，转染试剂用量，转染时间等）优化尝试，其次可尝试在其他细胞类型上进行转染。若由于实验模型限制无法使用其他细胞，可考虑更换转染试剂或转染方法（如电转）。
2. 检测目的基因表达水平
若目的基因在实验细胞中的表达丰度很低，是难以得到有效的沉默的。一般目的基因与GAPDH或ACTB的ΔCt值为10以内，比较适合做RNAi，若ΔCt值达到15以上则无法得到有效的沉默效果。对于目的基因表达丰度低的情况，建议更换实验细胞。
3. 优化siRNA浓度
siRNA在一定的丰度下才能达到理想的作用效果，故可根据推荐浓度（50nmol）进行预实验测试，再结合实验细胞系类型及目的基因的表达水平设置siRNA浓度梯度来优化siRNA最适浓度。
4. 检测分析方法有误
引物使用有误，检测时间点设置不合理，对照样本异常，实验样本检测数据不稳定等因素都会对后期实验数据分析造成影响，此类问题需根据具体的问题有针对性地进行分析调整。
5. 更换其他siRNA
若确定转染效果尚佳，其他因素也分析没有问题的情况下，却没有达到理想的基因沉默效果，则可以尝试更换其他siRNA来测试。由于RNA本身序列特性，或者靶位点的二级结构复杂等因素，有些siRNA的基因沉默效果可能没有那么显著，这种情况下可以尝试更换siRNA。
6. 其它原因
如目的基因的表达调控特性导致其难以沉默，并已排除转染方法，转染效率，基因表达水平及siRNA浓度等方面的问题，并尝试过5对以上siRNA，则应考虑更换细胞进行尝试。如无法更换细胞和感兴趣的基因，可以考虑更换为基因敲除的方式进行。
