作者，Evil Genius
我们2026空间转录组系列课程已经接近尾声了，大家回去要把分析思路和代码运用到自己的项目中，中间肯定会有很多的问题，一定要及时沟通。
关于xenium（cosmx等）平台的空间差异分析，主要从3个方面入手。
1、空间亚型（空间角度区分亚群）的分子差异（内部基因重编程）。
2、空间亚型微环境的分子差异（环境筛选压力）。
3、空间亚型邻域具体细胞类型（例如巨噬细胞）的差异表达基因（核心作用分子，区分“旁观者”和“参与者”）。
三种思路都要做一下。
今日我们分享文献
知识积累
进化将细胞间通讯作为协调器官发育的一种策略，从而能够可重复地生成精细复杂的结构。
肾脏是结构复杂的器官，其功能单位是肾单位，健康个体的肾单位数量差异很大（20万~200万个），数量少会增加高血压和慢性肾病风险。肾发育异常则是儿童慢性肾病的主因，但目前对人肾发育的研究存在技术限制。
肾单位由两类祖细胞形成：肾单位祖细胞（NPCs） 形成肾单位近端部分（肾小体及大部分肾小管），输尿管芽（UB） 形成连接小管和集合系统。NPCs位于输尿管芽顶端，随后逐渐上皮化，经历肾小囊泡、逗号形体和S形体等阶段，最终形成成熟肾单位，两类细胞来源的节段需连接才能形成功能性通道。
小鼠研究已发现一些关键的细胞间相互作用，但对其全貌仍不清楚，对人肾发育的了解更少。尽管小鼠和人发育通路大体保守，但存在关键差异。
近期研究利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和拟时间分析等手段描述人肾发育。小鼠研究显示NPC衍生中间体分为肾小体和肾小管两系（足细胞、近端小管、髓袢、远曲小管），而人研究则提示中间体先分“近端”和“远端”，近端再分化为足细胞和近端小管。
研究整合组织学、单细胞转录组和空间转录组，发现早期存在肾小管前系（近端小管、远曲小管、髓袢）和肾小体前系（壁上皮细胞、足细胞）的命运决定。更重要的是，我们发现了发育可塑性——已呈成熟近端小管转录状态的细胞可以转分化为壁上皮细胞。我们还通过空间定位，追踪了分化轨迹的分叉点及其与配体信号的关系，从而定位了细胞命运决定的调控位置。
结果1、发育中人类肾脏的单细胞RNA图谱
研究对5例孕周12.5至20.5周的人类胎儿肾脏进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），构建了包含65,289个单细胞的发育中人肾脏转录组图谱，涵盖五大谱系：肾单位、输尿管芽、间质、内皮和免疫细胞。
肾单位细胞进一步细分为：肾单位祖细胞（NPCs）、足细胞、壁上皮细胞（PECs）、近端小管（PT）、髓袢（LOH）细胞、远曲小管（DCT）以及中间态细胞（Int），各细胞类型标志物与文献报道一致。
关于NPC的年龄依赖性变化：
NPC在人类孕晚期耗竭，小鼠则在围产期耗竭。
本研究鉴定出467个在NPC中随孕周显著变化的基因。
通路分析显示，随着孕周增加，BMP/WNT通路、FOXO1和胰岛素信号活性增强。已知BMP/WNT在NPC上皮化和早期肾单位分化中起关键作用；FOXO1虽此前未在NPC中报道，但在胰岛素信号、代谢和WNT信号中具有重要功能。
关于其他细胞类型的年龄依赖性变化：
对每个细胞群体分别计算了与孕周相关的基因表达变化。
在成熟中的近端小管（PT）细胞中，随孕周增加而增强的通路包括：PT特异性溶质转运、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号和碳代谢通路。
而与增殖相关的通路则随孕周增加而减弱。
结果2、胎儿人类肾脏的细胞分化轨迹
cellrank。
谱系溯源：通过计算细胞来源概率，将插层细胞和部分连接小管细胞归为UB谱系，其余远端肾单位归为NPC谱系，解决了谱系划分难题。
早期二元决策：NPC先进入中间态，随后分为肾小管前（向PT、LOH、DCT分化）和肾小体前（向足细胞、PEC分化）两条路径，与小鼠研究一致。
更新vs分化：与NPC更新相关的基因在早期孕周高表达，与分化相关的基因在晚期孕周高表达，反映了发育进程。
发现——发育可塑性：分析发现PT与PEC之间存在直接转换，RNA速率表明方向为PT → PEC。免疫荧光验证了胎儿肾脏中存在ACE2阳性的PEC（即形态为PEC但表达PT分子标记），而成人肾脏中无此现象，提示这可能是胎儿特有的细胞命运可塑性机制。
空间转录组验证（人类）：在胎儿肾脏中，形态为PEC的细胞广泛表达PT标志物（HNF4A、CUBN、LRP2、ACE2），而儿童肾脏中无此现象，排除了非特异性表达或技术误差。
小鼠数据验证：小鼠单核数据分析显示PEC分为两群，其中靠近足细胞群的PEC具有更高的PT吸收概率，提示小鼠中也存在类似的细胞间转换。
克隆谱系示踪（小鼠）：利用Pax2+祖细胞标记模型，发现单个克隆的后代可同时贡献于PT、PEC和足细胞，证明单个肾单位祖细胞的子代可同时走向肾小体和肾小管命运。
结论：综合人类和小鼠数据证实，胎儿肾小体中部分形态学PEC实际表达PT基因，并随时间逐渐确立PEC身份。这一发现挑战了现有肾单位分化模型，提示需要对模型进行修正。
结果3、发育中人肾脏的空间分子特征
数据整合：将CosMx空间数据与scRNA数据通过scVI/scANVI联合分析，实现了空间上全转录组表达和分化轨迹的推算。
空间分布规律：各细胞类型的空间位置与已知组织学一致——NPC在最表层（UNCX+），中间态细胞在NPC下方（LHX1+、JAG1+），成熟结构如肾小体（足细胞标志NPHS2+）和PT（APOE+）位于更深处。
分化轨迹的空间映射：以“吸收概率”表示分化阶段，确认了表层→深层的发育梯度——最不成熟的细胞在最表层，越分化越深入组织。
早期谱系特化：足细胞和远曲小管（DCT）的特化发生在相对表层区域，说明命运决定在发育早期、空间上较浅的位置就已发生，与CellRank轨迹分析结果一致。
结果4、组织学邻域的分子特征
邻域-分化阶段对应关系：
胚基：拟时间最早，无特定命运富集 → 干细胞“家园”
原始上皮结构（如逗号形体）：拟时间稍晚，仍无特定命运富集 → 早期分化但尚未定型
早期肾小体：拟时间更晚，富集足细胞谱系 → 命运决定已在此发生
成熟足细胞：拟时间最晚，完全富集足细胞谱系
邻域细胞组成：
胚基主要由未分化肾单位细胞+基质细胞包围
原始上皮结构附近UB细胞最多（与NPC在UB旁分化吻合）
早期肾小体和足细胞中内皮细胞比例升高（提示血管生成参与肾小体成熟）
细胞的状态依赖于微环境：同一细胞类型在不同组织学结构中基因表达差异显著。例如中间态细胞在胚基中表达干性基因（SIX1/SIX2），在其他结构中则表达分化标志物——说明细胞身份并非固有，而是由所在邻域微环境塑造。
基质细胞异质性：对基质细胞进一步细分，鉴定了7种亚型并定位，扩展了既往对胎儿肾脏基质细胞多样性的认识。
结果5、空间分辨的无偏细胞-细胞相互作用分析
通过空间分辨的配体-受体分析，系统鉴定了调控肾脏发育中细胞命运决定的微环境信号：
分析方法：
CellPhoneDB：在预定义组织学邻域内筛选，发现569种空间合理的相互作用（含经典WNT/FGF/BMP通路）
CytoSignal：无偏、单细胞分辨率，考虑配体扩散，发现246种跨样本保守相互作用（含WNT4等关键节点）
关键发现——IGF2调控NPC更新：
相关性分析显示IGF2、GDNF、RSPO3与NPC更新高度相关
IGF2由NPC、基质细胞和UB产生，其受体在NPC中组成性表达
体外验证：小鼠肾外植体加IGF2→UB尖端增多、帽状结构增大；IGF1R抑制剂→SIX2+细胞丢失、结构紊乱
类器官验证：linsitinib减少SIX2+细胞和肾小管聚集体；IGF2增加SIX2+和JAG1+群体
结论：IGF2信号对NPC自我更新和早期分化具有正向调控作用
配体-命运关联图谱：
AVP：PT产生配体（无受体），DCT表达受体（不产配体）→提示AVP作为旁分泌信号同步不同节段分化
LOH：FGF9、KNG1
DCT：EFNA4、BMP3
足细胞：VEGFA、EFNB1（与已知功能一致）
肾小管命运：AGT
肾小体命运：BST2、JAG1
谱系间共享信号：UB和NPC远端群体共享肾母细胞瘤过表达蛋白和midkine信号，共同调控远端小管/连接小管命运。
结果6、基于无偏空间邻域的微环境分析
基于配体信号的无偏空间邻域分析方法
方法创新：不同于传统基于固定距离内细胞类型注释的生态位分析，本研究使用配体信号矩阵（而非基因表达）进行聚类，每个邻域由其微环境中可用的配体组合定义——这更直接反映了细胞实际接收到的外部信号。
邻域鉴定：成功识别出与经典组织结构对应的配体邻域，如GDNF邻域（胚基/NPC区）、VEGFA邻域（肾小球）、AVP邻域（集合管），并能够区分胚基、生肾区、皮质和髓质。
邻域-发育阶段映射：各配体邻域对应特定的分化阶段：
邻域10（胚基样）→ NPC更新
邻域7 → 早期NPC分化
邻域0 → 早期肾小管分化
邻域1 → 晚期肾小管分化
邻域8 → 肾小体成熟
预测能力：这些基于配体的邻域可预测不同细胞类型和分化轨迹的基因表达模式，说明微环境中的配体组合是决定细胞状态和命运的关键因素，为理解发育调控提供了全新视角。
最后，来看看方法
