了解测序

测序目前已经发展到了第三代，但是我个人感觉用的最多的还是二代测序。

一代测序

20世纪70年代，Frederic Sanger 发明了双脱氧终止反应法，通过加入ddNTP在扩增过程中结合到相应位置，然后利用电泳分开扩增的片段，读出一个一个的碱基，准确路十分高，但是低通量。

二代测序

二代测序，高通量，速度快，但是错误率增加。
主要的平台包括：　
1.罗氏454公司的GS FLX sequencer
2.Illumina solexa genome analyzer
3.ABI公司的SOLiD sequencer

流程

第一步

首先是建库，将DNA用超声波打断，然后用酶将末端补平，然后再3‘端加入一个A碱基，在两端加上互补配对的adapter，再通过PCR扩增达到一定浓度，构成单链DNA文库。

第二步

上样至flowcell（流动池中，里面有不同的lane），DNA片段与lane表面的短序列配对，进行桥式PCR扩增

扩增

加入碱性液体解聚，冲刷掉未共价结合的DNA模板链，继续扩增

扩增

扩增

桥式PCR完成后，通过切割，冲洗形成单链DNA。

第三步

接下来进行测序，加入测序引物以及含叠氮基团及荧光基团的dNTP，这样边合成边测序，加入化学试剂淬灭荧光信号并使dNTP 3’ 叠氮基团变成羟基，继续进行下一步合成直至所有测完。
完成之后进行index1的测序，通过index1的引物来测定，之后再测index2序列。

index测序

之后就再进行桥式PCR，只不过这次最后留下来的是Reverse模板链，就相当于反向测序一次，这样就完成了双端测序。

三代测序

三代测序发展方向太多，人们希望提高测序效率、提高测序通量、提高测序准确率、避免PCR扩增和避免荧光检测等等。但准确率同样变低。
三代测序包括：
Pacific BioSciences公司的实时单分子测序（real-time single-molecule）和complete genomics公司的复合探针-锚定连接技术（combinatorial probe-anchor ligation，cPAL），都依靠荧光检测来测序，但他们提高的是测序速度和通量；
Life technologies公司的离子流探测测序设备（Ion torrent）使用离子流场效应半导体感应器（ion-sensitive field effect transistor）,依靠边合成边测序的中心概念，检测每次添加碱基时候释放出的离子流，从而避免了传统第二代的荧光检测；
Oxford nanopore公司的纳米孔单分子测序技术，同样也避免了荧光检测和对主体DNA序列的PCR扩增。
三代测序对比如下图（图来自生信星球）

三代测序对比

NGS组学

1.基因组学

（1）全基因组测序（WGS）
（2）全外显子组测序（WES）
（3）简化基因组测序（RRGS）

2.转录组学

（1）mRNA-Seq
（2）IncRNA-Seq（长链非编码RNA）
（3）sRNA-Seq（主要是miRNA-Seq）

3.蛋白质组学

4.代谢组学

最后是思维导图

思维导图

组学分类