1.打开含基因ID的原始文件——引物设计原始DNA信息2.选中Gene id中的所有基因名称，复制
3.打开Tbtools，依次选择Sequence Toolkits；Fasta tools；Fasta Extractor4.将gene id粘贴到对应位置，并按上图所示将“小麦cDNA库”拖到第一个框，在第二个框设置输出文件（例子中的输出文件名为out.fa）5.点开始提取序列
6.打开primer6软件，点文件夹+导入输出文件out.fa，拖拽选中前10个文件进行引物设计（软件最多可同时设计10个引物）7.点 红蓝箭头设计引物，修改PrimerParameters如图，点Search，选取6图左侧框中的任一引物，接第8步
8.点All Primers… ,会出现上图，选取其中Rating（看综合评分即黑色评分）较高，且Lenth bp中蓝红数字在10以上，30以内（最好是10-20之间），黑色数字在100-200之间（最高不超过300）的引物。9.选完以后，单机该引物一栏，待该栏变蓝色后，点Replace即可将该引物设置为最佳引物
10.设计完引物后即可将结果输出，输出可分两种，一种是只要最佳引物序列（给公司发邮件时可以用），另一种是输出所有引物的信息,点击File出现10图所示界面，点Export Primer Result，出现10-1图，安照10-1图所示设置参数（可自行设置输出文件名）即得到最佳引物序列，安照10-2图所示设置参数即得到所有引物的信息（作业所需为两个表格）
因为网站显示不全，所以我把详细教程做了一个PPT，还把对应的软件放在了一个压缩包里，大家可以自行下载查阅
链接：https://pan.baidu.com/s/1HyoRyPT6N7SxYgU1pPaR2Q
提取码：g0q8
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