影响因子：6.1
研究概述：
系统性硬化症(SSc)是一种以组织纤维化为特征的自身免疫性疾病，可发生在躯干、四肢和内脏器官的皮肤中。由于缺乏可以停止或逆转纤维化过程的治疗方法，肺纤维化可导致间质性肺病(ILD)的发生，这也是SSc死亡的主要原因。根据SSc亚型和用于定义不同国家ILD的标准，SSc患者ILD的患病率在25%至90%之间；而系统性硬化症相关的间质性肺病(SSc-ILD)主要发生在30-55岁的女性中。特发性肺纤维化(IPF)在大约60-75岁的男性中更为普遍。SSc-ILD比IPF发生得更早、进展更快。研究发现，巨噬细胞通过吸引免疫细胞和刺激胶原过度产生在肺纤维化中起着关键作用。目前，以确定了三种类型的巨噬细胞(FCN1，FABP4和SPP1)参与肺纤维化的发病机制。携带MERTK和LGMN的SPP1巨噬细胞可能促进促纤维化活性。而SPP1巨噬细胞组在SSc-ILD和IPF中表达上调。本研究旨在通过单细胞分析以确定SSc-ILD和IPF之间的差异，同时阐明其独特的病因，为该疾病的预防和治疗提出指导方向。
研究结果：
ILD样本分析
作者首先对四名IPF患者、三名SSc-ILD患者和来自GSE159354数据集的三名HCs样本(健康对照组)进行了scRNA-seq(图1A)，并通过使用Seurat软件对过滤后的基因进行了批量校正。接着，作者对两组SSc-ILD或伴HCs的IPF患者的样本进行了生物信息学分析，共分析了约200500个细胞(图1B)。最终在含有HCs的SSc-ILD组中鉴定出19个簇(图1C)，在和含有HCs的IPF组中鉴定出23个簇(图1D)。而根据用于注释和识别簇的标记基因发现两组细胞簇相似(图1C, D)。
肺巨噬细胞执行SSc-ILD特异性的MAPK信号通路
作者通过对所有样本的富集分析发现有2个聚类组与肺纤维化高度相关：炎症过程和补体级联以及伤口愈合过程(图1E)。由于这两组样本(SSc-ILD, IPF)表现出相似的聚类模式和GO富集结果，作者进一步进行了MCODE分析。结果显示，在SSc-ILD组中发现了丝裂原活化激酶磷酸酶(MAPK)信号通路，但在IPF组中没有。因此，作者想确定哪一组细胞执行了MAPK。通过对成纤维细胞、上皮细胞、单核细胞、肺泡巨噬细胞和巨噬细胞的KEGG富集分析分析发现，巨噬细胞执行执行了MAPK(图S1G-J, 图1F)；相比之下，IPF中的同一组巨噬细胞经历了Th17细胞分化(图1F)。
单核细胞来源的肺巨噬细胞
在簇2、簇4和簇7的单核细胞/巨噬细胞中，差异表达基因(DEGs)包括簇2中的FCN1、S100A8和IL1B；簇4中的APOC1、MARCO、FABP4和SPP1；以及簇7中的HLA-DPB1、GPR183和CCL3(图2A)。而根据CellMarker 2.0数据库注释，簇2、4和7分别对应于单核细胞、肺泡巨噬细胞和巨噬细胞(图2B)。为了确定这些簇内巨噬细胞的来源，作者进行了单细胞RNA-seq拟时序分析以区分这三种细胞类型之间的相似性。结果发现，从单核细胞开始到达肺泡巨噬细胞，首先必须穿过巨噬细胞；而从单核细胞到肺泡巨噬细胞和巨噬细胞有不同的分化途径。因此，作者推测巨噬细胞与单核细胞的关系更为密切，而肺泡巨噬细胞可能更早到达肺组织并经历更多分化，最终导致与单核分子的显著差异。因此，作者得出结论，巨噬细胞更有可能是从单核细胞分化而来(图2C)。
SSc-ILD肺泡巨噬细胞亚群
最开始，作者使用已发表的数据集GSE212109，对5名SSc-ILD患者和6名HC患者的肺组织样本进行了分析(图1A)。在scRNA-seq分析中，作者共鉴定出27个簇(图2D)。根据用于注释簇和分配标识的标记基因，簇2和簇7对应于单核细胞；簇8对应于巨噬细胞；簇1、簇3、簇12和簇26对应于肺泡巨噬细胞。在肺泡巨噬细胞亚群中，簇1由表达FABP4和MARCO标志物的细胞组成；簇3和簇26为表达SPP1的细胞组成；簇12由同时表达FAPB4和SPP1的细胞组成(图2E)。该结果与已发表的数据集GSE159354一致。在这里，作者确定了两组簇4-肺泡巨噬细胞，一组具有关键基因FABP4和MARCO，另一组具有MARCO和SPP1关键基因(图2A)。
细胞-细胞相互作用推断(配体-受体相互作用)
鉴于基因表达的差异，作者接下来将重点转移到了细胞间相互作用是如何导致SSc-ILD以及导致与IPF相比更早的疾病发作。通过候选信号通路的细胞簇相互作用之间的功能差异，作者观察到II型肺泡细胞、上皮细胞、分泌细胞和杯状细胞在损伤后倾向于产生UGPR1、SAA和补体信号通路(图3A, B)。UGPR1激活携带MARCO的肺泡巨噬细胞(图3C)，而补体信号通路影响肺泡巨噬细胞以驱动额外的免疫和修复反应(图3D)。相比之下，SAA作用于单核细胞并引发随后的炎症反应(图3E)。随后，肺泡巨噬细胞产生SPP1和BAFF(图3F, G)。值得注意的是，SPP1不仅作用于成纤维细胞和上皮细胞进行即时修复(图3F)，还靶向单核细胞进一步通过VEGF和VISFATIN信号通路启动另一种修复途径(图3H, I)。而在单核细胞内，巨噬细胞的一个独特亚群通过与内皮细胞特异性相互作用来执行这一信号通路。研究证实，BAFF与B细胞相互作用，产生被认为与自身免疫反应相关的自身抗体。
IL-6通常被认为是一种炎性细胞因子，作者观察到IL-6并非由典型的免疫或炎性细胞产生的，而是由成纤维细胞、肌成纤维细胞和内皮细胞产生，它作用于上皮细胞以促进修复过程(图3J)。作者还发现许多细胞，特别是肥大细胞，会产生ANNEXN，主要作用于单核细胞和肺泡巨噬细胞，而不影响巨噬细胞(图3K)。研究表明，ANNEXIN通过甲酰肽受体(FPR)抑制炎症反应。然而，巨噬细胞缺乏膜联蛋白FPR轴信号通路。而当巨噬细胞不受ANNEXIN抑制时，这可能是VEGF和VISFATIN持续作用的原因。
作者还发现肥大细胞在单核细胞的反馈抑制中起着关键作用。在之前的研究中，发现单核细胞具有FPR1和FPR2两种膜联蛋白受体。FPR1主要表现出抗炎作用，而FPR2有助于单核细胞分化为巨噬细胞，以实现外排细胞的作用。然而，在SSc-ILD中，一旦单核细胞分化为巨噬细胞，FPR1和FPR2便都消失了(图S2F)，这使得肥大细胞对巨噬细胞的反馈抑制被消除。相比之下，IPF中的单核细胞仅具有FPR1，分化为巨噬细胞后，剩余的FPR1出现。因此，在IPF中，肥大细胞的反馈抑制在单核细胞、肺泡巨噬细胞和巨噬细胞中持续存在(图S2G)。
SSc-ILD的生物学途径和发病机制
图3L展示了SSc-ILD的生物学途径。研究表明，当肺组织中的前线细胞(如II型肺泡、上皮、分泌和杯状细胞)暴露于外部或内部损伤时，它们最初会向肺泡巨噬细胞发送UGPR1信号。因此，肺泡巨噬细胞通过SPP1激活成纤维细胞和其他细胞，如肌纤维细胞和内皮细胞。内皮细胞可通过内皮细胞到肌成纤维细胞的转变(EndMT)和伴随的微血管稀疏来充当肌成纤维细胞的来源。随后，通过IL6、ERK和pI3k-Akt通路驱动上皮细胞和成纤维细胞等细胞继续修复受损组织，该修复过程有助于肺纤维化(图3L)。
此外，肺泡巨噬细胞产生的SPP1驱动单核细胞，在招募的单核细胞中，由于SSc的缺氧特性，一些分化为特定的巨噬细胞激活VEGF和VISFATIN信号通路，进一步驱动下游p38-MAPK通路。这一过程有助于肺纤维化的发展(图3L)。虽然存在抑制肺泡巨噬细胞和单核细胞的机制，特别是肥大细胞通过ANNEXIN抑制炎症，但这种反馈机制并不作用于巨噬细胞。因此，氧化应激引起的炎症无法被抑制，导致恶性循环和炎症诱导的肺纤维化的早期加速发作。肺泡巨噬细胞还通过BAFF驱动B细胞产生自身抗体，这可能会持续影响自身免疫。
肺巨噬细胞MAPK信号通路的p38-MAPK和JUN
作者观察到激活MAPK信号通路的巨噬细胞的这一特定亚群导致SSc-ILD的早期发作。随后作者使用SCENIC来预测转录因子(TFs)和推断的靶基因。结果发现了两组调节子：第一组包BCLAF1、IRF1和NFE2L2；第二组包括JUN、FOS和FOSB(图4A)。而在这两个调控子组中，每个TF的靶基因都属于MAPK信号通路(图4B)。通过分析TF和靶基因的调控网络发现，BCLAF1调节IRF1、NFE2L2和JUN；同时，JUN受FOS和FOSB的调节，这会影响其下游基因(图4C)。
转录因子的药物靶向预测
由于巨噬细胞TFs是MAPK信号通路的重要靶点。因此作者使用了DrugBank数据库以绘制针对这些TFs的药物图谱。在潜在的药物中，作者选择了对TFs具有下调作用的药物，并排除了具有争议性性结果或对其他TFs具有上调作用的药物。此外，我们将选择范围缩小到adjusted p <0.05 (表1)。最后发现二甲双胍下调NFE2L2。众所值周，二甲双胍是一种双胍类药物，用于治疗2型糖尿病。它在其他疾病中也有优势，包括癌症和肝肾疾病。研究也证实二甲双胍可以以剂量依赖的方式抑制Raf和ERK的磷酸化，从而进一步抑制NFE2L2的表达。
研究总结：
本研究基于GEO的单细胞测序数据集(GSE159354和GSE212109)，通过对健康对照组、IPF组和SSc-ILD组的肺组织样本进行单细胞分析发现，在SSc-ILD的肺损伤初期，成纤维细胞在SPP1肺泡巨噬细胞的影响下激活IL6通路。然而，IL6似乎与其他炎症和免疫细胞无关。同时，作者们还观察到激活MAPK信号通路的巨噬细胞的特定亚群。而与IPF相比，由于SSc-ILD缺乏来自膜联蛋白的抑制反馈和自身免疫特性，作者推断这可能是SSc-ILD发病较早和持续纤维化的原因。最后，作者鉴定出了两种转录因子(BCLAF1和NFE2L2)以及它们与MAPK相关的下游靶基因，这可能是早期预防和治疗的潜在治疗靶点。同时，作者发现二甲双胍下调了NFE2L2，而NFE2L2可以作为一种再利用的候选药物。总之，该研究发现SSc-ILD和IPF之间存在差异，这些差异可以作为早期预防和治疗的潜在研究方向。
