非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种新兴的全球健康威胁，并迅速成为慢性肝病的主要原因，影响全球25%的人口。NAFLD的发展范围从简单的脂肪变性到晚期的非酒精性脂肪性肝炎（NASH），其特征为肝细胞损伤和肿胀，肝脏炎症和肝纤维化。NASH不断恶化可导致肝硬化性肝病和终末期肝细胞癌（HCC）。近年来，越来越多的证据表明，西式饮食（WD）和肠道微生物群相互作用产生的代谢物，会导致NAFLD的恶化。然而，促进NAFLD的特定细菌和代谢物以及潜在的机制尚不清楚。

2023年1月16日，在期刊Nature Communications（IF=17.694）报道的题为：“Western diet contributes to the pathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis in male mice via remodeling gut microbiota and increasing production of 2-oleoylglycerol”的研究成果，作者将一种胆碱低、高脂肪和高糖饮食代表典型的西方饮食（CL-HFS），成功地建立雄性小鼠的NASH模型。后通过16SrRNA测序和代谢组学分析了导致 CL-HFS 诱导的NASH的临床相关细菌和代谢介质，为开发基于微生物组或代谢物的NASH的治疗策略提供方向。

研究思路 

研究结果

1. 用CL-HFS（典型WD）建立临床相关的小鼠NASH模型

作者用CL-HFS喂养WT C57BL/6 小鼠，后从组织学、免疫组织化学、生化和分子方面分析表明，CL-HFS摄入会导致脂肪肝、肝损伤、先天性肝脏炎症反应、ECM基因上调、肝纤维化以及肥胖，反映了人类疾病中典型的NASH特征。整体说明该模型具有临床相关性，可用于NASH发病机制及其潜在机制的研究。

图1 小鼠NASH模型的建立和表征

2. 抗生素混合物（ABX）治疗可调节CL-HFS诱导的肠道微生物群和肝脏代谢物的变化

利用小鼠粪便样本进行了16S rRNA基因测序，基于操作分类单元（OTU）和β多样性分析发现，CL-HFS的摄入会导致Blautia（厚壁菌门）丰度的增加以及Akkermansia（疣菌门）的数量增加，Alistipes（拟杆菌门）和Muribaculaceae（拟杆菌科）的数量减少。结果表明，ABX抑制CL HFS引起NASH的发病机制，与肠道微生物的变化相关。

对ABX或对照处理的ND和CL HFS喂养小鼠的肝脏进行了非靶向气相色谱-质谱（GC-MS）分析。单因素方差分析及差异筛选发现，检出的309种代谢物中，50种发生显著变化。其中，ND组和CL HFS组之间5种代谢物存在显著差异，CL-HFS处理组中苯丙氨酸（Phe），焦谷氨酸（PCA）、2-OG、半胱氨酸（Cys）和L-缬氨酸（Val）表达显著增加，ABX处理组中该变化消除。结果表明，CL-HFS和ABX都重塑了肠道微生物群，显著影响肝脏代谢组。

图2 ABX治疗改变肠道微生物群和肝脏代谢产物的分布

3. NASH患者的粪便Blautia和肝脏2-OG也增加

借助NAFLD患者公开的人类微生物组数据库，作者对健康人群和NAFLD患者的肠道微生物群进行了比较分析，发现Blautia在人类和小鼠中对NASH和HCC发病机制均发挥作用。

作者重点研究了NASH患者肝脏中显著差异的五种代谢产物（与上述小鼠的一致），发现其对CL-HFS和ABX治疗的反应极为明显。后对8名肥胖患者肝脏样本进行代谢分析发现，与无NASH患者相比，肥胖患者和NASH患者中的2-OG显著增加，而其他四种代谢物则无相关性。此外，还检测到4-羟基丁酸显著增加。结果表明，小鼠和人类NASH患者中的Blautia和2-OG均增加，可能作为促进NASH的细菌和代谢产物。

已有研究表明，细菌脂肪酶可以消化三酰基甘油产生2-OG。在厌氧条件下培养双歧杆菌，通过GC-MS分析检测到培养基中2-OG的产量显著增加。与ND处理的小鼠或ABX处理的CL-HFS喂养小鼠相比，血清中循环的2-OG也增加。体内研究表明，用B. producta重新繁殖ABX5灭菌小鼠会导致2-OG在肝脏中积累。这些结果表明，2-OG是由CL-HFS和与NASH发育相关的脂肪酶产生细菌相互作用产生的代谢物。

图3 肥胖及有或无NASH的患者肝脏代谢物的差异分析

4. B. producta 促进CL-HFS喂养小鼠的肝脏驻留MΦ和HSC活化

作者用ABX5治疗小鼠两周，然后在喂食CL-HFS的同时给小鼠口服B. producta。以Alistipes putredinis作为对照。11周后分离每只小鼠的肝非实质细胞（NPC）用于流式细胞术测定。结果表明，在CL-HFS喂养的小鼠中，用B. producta重新繁殖仅显著增加了表达CD11b和F4/80的肝脏驻留MΦs的频率和细胞数量；此外，还导致了表达α-SMA和Col1α活化HSC的频率和细胞数量显著增加。组织学分析、天狼星红染色、IHC染色和qPCR检测显示，B. producta导致炎症细胞肝脏浸润，胶原蛋白和α-SMA的产生，以及ECM基因表达增加。这些结果表明，在CL-HFS诱导的NASH过程中，B. producta可以激活MΦs和HSC并增强肝纤维化。通过CL-HFS诱导的NASH对小鼠的肠道进行灭菌，然后进行B. producta重新接种，结果证实了B. producta作为一种促进NASH的细菌，在ND和CL-HFS喂养的小鼠中激活NASH的启动和进展期间激活MΦs和HSC。

图4 B. producta 再增殖促进 CL-HFS 诱导的肝纤维化与肝脏驻留 MΦ 的调节相关

5. 2-OG通过TAK1 / NF-κB / TGF-β1信号通路引发MΦ启动激活HSC

为了研究作为细胞基础的MΦ和HSC是否介导2-OG引起的NASH发病机制，作者用2-OG刺激单独或共培养的小鼠永生HSC和RAW264.7细胞24小时 。通过qPCR测量的Acta2、Col1a1和Col4a1的表达仅在共培养细胞中增加，Gpr119、IL1b和Tgfb1也显著增加。2-OG还刺激了WT小鼠肝NPCs和脾细胞中MΦs的频率显著增加，然而，其他四种改变的代谢产物或与CL-HFS相关的代谢产物丝氨酸未发现这些影响。此外，2-OG不增强TGF-β1诱导的HSC激活，以刺激Col1a1、Col4a1和Acta2比TGF-β2单独增加。这些结果表明，2-OG作为代谢介体以MΦ依赖的方式激活HSC。

图5 2-OG引起ND喂养小鼠的肝纤维化，与肝脏驻留MΦs的调节有关

作者评估了小鼠GPR119的三种不同siRNA抑制其表达的能力。使用功能验证的siRNA，证明了siRNA介导的RAW264.7细胞中GPR119敲除消除了共培养HSC中2-OG-诱导的ECM基因的上调，这表明GPR119对于2-OG-诱发的MΦ激活是必要的。qPCR分析、体内及体外研究表明，GPR119/TAK1/NF-κB/TGF-β1信号通路介导HFS诱导的NASH肝脏中2-OG-诱导的MΦ激活，生成的TGF-β-1作为公认的激活HSC的主调节因子。

图6 2-OG 无法激活 GPR119 敲低 MΦ 及其共培养的 HSC

研究总结

该研究构建了一种具有典型西式饮食的临床相关的小鼠NASH模型，以研究NASH的发病机制。揭示了B. producta和2-OG为NASH相关细菌和代谢调节因子，细胞和分子层面揭示了GPR119 / TAK1 / NF-κB / TGF-β1信号通路介导2-油酰甘油诱导的巨噬细胞启动和随后的肝星状细胞活化，为开发基于微生物组/代谢物的非酒精性脂肪性肝炎的治疗策略提供了靶点。

参考文献

Yang M, Qi X, Li N, et al. Western diet contributes to the pathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis in male mice via remodeling gut microbiota and increasing production of 2-oleoylglycerol. Nat Commun. 2023;14(1):228.