什么是ROS1基因融合
基因融合是指一个基因在某一点上异常断裂，与另一个基因融合，形成一个由两个原本相距遥远的基因组成的杂交基因。基因融合也被称为基因重排，即基因在染色体上的排列顺序发生变化。这些融合或重排可能是几个异常遗传事件的结果，如缺失、重复、反转或易位。异常融合的基因可以导致癌症的发生并促进其生长，因为这些融合事件可能会将两个独立时可能不致癌的基因并列，但融合后可以刺激彼此的活性，从而导致细胞活动的异常，甚至致癌。
ROS1基因融合是染色体内（同一染色体断裂和异常重新连接）异常重排或染色体间（不同染色体断裂和异常重新连接）异常重排的结果，导致ROS1基因与多种伙伴基因并列。
当这些基因中的一个被破坏、变异或重新排列时，它们就会编码出异常蛋白质，这种蛋白质随后会执行异常功能，例如驱动癌变的发生发展。ROS1基因融合是致癌的，并且在多种癌症中都有发现：最早于1987年在胶质母细胞瘤（GBM）中发现，然后2007年在非小细胞肺癌（NSCLC）中发现，其他癌症包括胆管癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌等。
ROS1融合基因检测要点
近年来，随着肺癌分子生物学机制研究的不断深入和靶向治疗的发展，已有10余种驱动基因在肺癌中被发现，除了EGFR、ALK等人们熟知的基因突变，ROS1这一罕见驱动基因也逐渐走入人们的视线。ROS1变异主要为ROS1基因与其他基因发生断裂融合，多发生在NSCLC（非小细胞肺癌），阳性率约为1%-2%[1]。ROS1融合阳性NSCLC年龄偏小（中位年龄49.8岁），多为女性、从未吸烟/轻吸烟者患者，且主要发生的组织类型为腺癌。成功检测出ROS1融合基因是合理治疗的关键，也是对其进行个体化治疗的前提。
目前针对ROS1融合基因的常用方法有4种：
荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、免疫组织化学法（immunohistochemistry，IHC）、逆转录聚合酶链反应（reverse transcription- poly merase chain reaction，RT-PCR）及二代测序技术（next-generation sequencing，NGS），且在临床实践中各有优劣。
1. 荧光原位杂交FISH
FISH是目前检测肿瘤组织中染色体重排最有效的诊断技术之一，不仅可以检测已知的融合突变，也可以检测未知的融合突变，而且结果具有可靠性及稳定性，也是目前检验其他检测技术准确性的最重要的手段。
ROS1融合基因检测采用分离探针试剂设计。ROS1分离探针包括两部分，一部分识别分离点5’ 端（端粒）附近点基因序列，另一部分识别融合分离点3’ 端（着丝粒）附近点基因序列。３′端探针通常 被标记成绿色，５′端探针标记为橘红色或红色。当样本中≥15％细胞出现分离信号形态（红色和绿色信号分离）或者单一3’信号形态（单独绿色信号）诊断为ROS1基因融合阳性。但因检测成本较高、需要专业设备及人员、试剂昂贵、荧光信号消减迅速等缺点，限制了该法的广泛应用。
2. RT-PCR
RT-PCR检测具有灵敏性高、特异性强、简便快速的特点，在实验室中应用更为广泛，可检测所有融合型但不能区分融合类型。
目前，对于ROS1 PCR检测多数采用real-time RT-PCR技术。real-time RT-PCR技术是RNA逆转录cDNA和荧光定量PCR扩增相结合的一种技术，首先经逆转录酶和特异性引物作用下，将RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板扩增目的片段。该技术在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值对未知模板进行定性和定量分析直接检测基因融合状态的一种方法。
目前，国家食品药品监督管理局（NMPA）已经批准多个ROS1阳性NSCLC的real-time RT-PCR诊断试剂盒。
3.IHC
IHC可作为常规ROS1融合基因的筛选手段。与FISH技术相比，IHC成本低，快速准确，临床应用更为广泛。IHC检测通过显色剂标记抗体，利用免疫反应的特异性来确定抗原。
在NSCLC患者中，目前可用于ROS1融合基因筛选的抗体主要为D4D6（Cell Signaling Tech公司），检测ROS1融合蛋白的灵敏度和特异度分别达到了100％和 85％-100％。因为使用IHC进行ROS1检测，操作方法、判读标准也不统一，导致各检测中心的检测结果存在较大的波动性。
我国《ROS1阳性非小细胞肺癌诊断病理专家共识》评判标准如下：
IHC 3+: &10%的肿瘤细胞呈现深棕色强着色；
IHC 2+：&10%的肿瘤细胞呈现棕色着色；
IHC 1+: &10%的肿瘤细胞呈现微弱棕色着色，且无任何背景染色；
IHC 0：肿瘤细胞无明显着色或≤10％微弱棕色着色。
IHC检测的强阳性与RT-PCR/FISH检测阳性之间存在高度的一致性，但中度阳性及弱阳性与RT-PCR/FISH检测阳性之间一致性较差。对于IHC 1+以上的患者，建议使用RT-PCR/FISH进行ROS1融合基因的确诊。
深棕色强着色（IHC 3+)，且ROS1 FISH检测也确诊为阳性（红色和绿色信号分离）
4.NGS
NGS又称高通量测序，广泛应用于医学领域中肿瘤的预防、检测及治疗，能够准确检测已知的基因及其他基因的突变。
NGS分为基于DNA的NGS或基于RNA的NGS和基因扩增的NGS与杂交捕获的NGS，操作流程复杂，包含杂交捕获、建库、测序、数据分析、变异注释等流程。
NGS对于操作人员及操作环境的要求高，检测周期长（针对涵盖基因数量不同的检测panel，需3 d-10 d出报告），但NGS检测技术具有其不可替代的优势：一个平台一份样本即可得到多个基因检测结果，而需要多个技术平台，多份样本；NGS能检测未知基因变异，而传统检测技术未能检测未知融合。相比传统基因检测方法，NGS检测有明显的技术优势。但传统基因检测方法因临床可及性高和单次检测成本较低而在临床应用广泛。
NGS流程—分子诊断检测流程长，缺乏规范，每个步骤极易引入变量
总结：在临床实践中，怎样有效规范地应用现有的检测体系，最大化地筛选出ROS1阳性的患者，是ROS1阳性患者获得靶向药物治疗的关键。
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