影响因子：8.44

关于非肿瘤生信，我们也解读过很多，主要有以下类型

1 单个疾病WGCNA+PPI分析筛选hub基因。
2 单个疾病结合免疫浸润，热点基因集，机器学习算法等。
3 两种相关疾病联合分析，包括非肿瘤结合非肿瘤，非肿瘤结合肿瘤或者非肿瘤结合泛癌分析
4 基于分型的非肿瘤生信分析
5 单细胞结合普通转录组生信分析

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研究概述：

糖尿病性心肌病(DCM)是糖尿病常见的心血管并发症之一，也是糖尿病患者死亡的主要原因之一。线粒体代谢和免疫炎症是DCM发病的关键，但它们在DCM中的相互作用仍悬而未决。

本研究利用生物信息学方法探讨了线粒体代谢和免疫微环境在DCM中的独立作用及相互作用，首先从GEO的3个DCM相关微阵列数据集中获得了DEGs，发现DEGs富集于线粒体代谢、免疫炎症和胶原合成相关通路，为验证发现建立了DCM大鼠模型，全文旨在分析线粒体代谢和免疫失调在DCM发生发展中的调控作用，并探索相关靶点。结果可能有助于更好地理解DCM中的线粒体代谢、免疫及其相互作用。

流程图：

研究结果：

一、DCM中的DEGs和功能富集分析

1. 将差异分析可视化为火山图和热图(图2a-f)，与正常样本相比，DCM样本中：

GSE4745数据集中有293个DEGs，上调基因有149个，下调基因有144个;

GSE5606数据集中有544个DEGs，上调基因269个，下调基因275个;

GSE6880数据集中有463个DEGs，其中上调基因262个，下调基因201个。

2. GSEA显示，三个数据集中的DEGs主要参与脂质和脂肪酸代谢及免疫相关通路，包括脂质代谢、PPARα对脂质代谢的调控、脂肪酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、抗原加工和呈递、MHC II类抗原呈递、内源性配体对TLR的调控、补体激活(图2g-n)。

此外，胶原合成、胶原原纤维组装和氧化应激相关途径也被富集。

3. DEGs富集的GO通路分为生物过程(Biological Process, BP)、细胞成分(Cellular Component, CC)和分子功能(Molecular Function, MF)，主要包括线粒体功能及成分、能量代谢、炎症免疫、缺氧及氧化还原反应、胶原合成、胰岛素敏感性等(图3a-f)。

4. DEGs富集的KEGG通路以线粒体代谢与功能、缺氧与氧化还原反应、物质生成、免疫等通路为主(图3g-l)。

二、DCM 中的线粒体相关DEGs

1. 在MitoCarta3.0数据库中检索线粒体相关基因，在3个数据集中选取与DEGs重叠的基因作为MitoDEGs（MitoCarta3.0数据库收录了1136个人类和1140个小鼠的蛋白编码基因，这些基因均定位在线粒体定位上）。GSE4745数据集有32个 (15个上调，17个下调)， GSE5606数据集有34个 (18个上调，16个下调)， GSE6880数据集有25个 (14个上调，11个下调)(图4c-e)。

2. 将每个数据集的MitoDEGs进行组合，得到67个重叠的MitoDEGs，与正常样本相比，DCM样本中表达上调的基因有35个，表达下调的基因有32个。

三、PPI网络分析和枢纽线粒体相关DEGs识别

1. 使用STRING数据库进行分析67个MitoDEGs的PPI，并与Cytoscape进行网络可视化(图4f)。一个由9个节点和17个边组成的模块被鉴定为显著性模块(图4g)，基因参与的模块有：Acsl6、Acadsb、Decr1、Ivd、Oxct1、Gpam、Pdk4、Hmgcs2、Acot2。

2. 利用插件CytoHubba的MCC算法，从PPI网络中鉴定出10个候选枢纽基因，包括Cpt1a、Hsd17b4、Hmgcs2、Acadsb、Decr1、Acot2、Gpam、Oxct1、Acsl6和Ivd(图4h)。

3. 结合上述结果，最终获得Acadsb、Hmgcs2、Hsd17b4、Gpam、Acot2、Ivd、Decr1、Cpt1a、Acsl6、Oxct1、Pdk4等11个候选枢纽基因。

四、Hub MitoDEGs与DCM/HF的关系及hub MitoDEGs -TFs- miRNAs调控网络

1. Cpt1a、Gpam、Hmgcs2和Acadsb与DCM的相关性最高，而Cpt1a、Pdk4、Gpam和Hmgcs2与HF的相关性最高(图5a，b)。

2. c图是 TF-hub MitoDEGs调控网络:红色方格为hub MitoDEGs，黄色圆点为19个转录因子。对枢纽MitoDEGs的miRNA进行预测，生成一个包含299个节点和569条边的调控网络(图5d)：红色方格代表hub MitoDEGs，紫色圆点代表miRNA。

3. 有三种miRNAs，包括①与Ivd、Acsl6、Acot2和Hmgcs2相互作用的miR-298-5p;

②与Oxct1、Ivd、Cpt1a和Acsl6相互作用的miR-30c-1-3p;

③与Oxct1、Cpt1a、Acsl6和Hmgcs2相互作用的miR344b-5p。但还需要进一步的验证。

五、DCM中的免疫细胞浸润

1. 使用ImmuCellAI算法分析得出DCM组与CON组9种免疫细胞心肌浸润情况差异有统计学意义。DCM组中B细胞、边缘区B和记忆B的含量更高，而CON组中颗粒细胞、树突状细胞、MoDC、cDC1、pDC和cDC2的含量更高(图6a-c)。

2. 进一步分析DCM中浸润的免疫细胞，发现细胞间存在多重相关性(图6d)。相关程度用分数表示。CD4 T细胞与幼稚CD4 T细胞的协同作用最强(0.99)，其次是CD4 T细胞与T辅助细胞(0.98)，CD8 T cm与CD8 T ex (0.98)， 幼稚CD4 T与T辅助细胞(0.97)。

相比之下，幼稚 CD8 T与B细胞之间的竞争效应最强(-0.72)，其次是pDC和Marginal Zone B (-0.69)，Naive CD8 T与Memory B(-0.69)。

六、MitoDEGs/hub MitoDEGs与免疫细胞的关系

1. 图7a, b显示MitoDEGs有35个上调，32个下调。

2. 图7c显示在11个枢纽MitoDEGs中：

Pdk4与边缘区B呈正相关，而与cDC2, MoDC和pDC呈负相关。

Oxct1与pDC和CD8 Tem呈正相关，Ivd与CD8 Tem呈正相关，

Hsd17b4与边缘区B、M2巨噬细胞呈正相关，与cDC2、MoDC、pDC呈负相关;

Hmgcs2与边缘区B、M2巨噬细胞呈正相关，与粒细胞、cDC2呈负相关;

Gpam与树突状细胞、粒细胞、cDC1和MoDC呈负相关;

Decr1与边缘区B、M2巨噬细胞呈正相关，与粒细胞、cDC2、pDC呈负相关;

Cpt1a与树突状细胞、cDC1、MoDC和pDC呈负相关;

Acsl6与pDC、嗜酸性粒细胞和CD8 T em呈正相关;

Acot2与树突状细胞和cDC1呈负相关。

七、DCM大鼠的一般生物学和超声心动图特征

1. 造模过程中，DCM组高脂饮食喂养的大鼠体重显著高于CON组，且在注射STZ2周后开始有下降趋势，明显低于组织采样前的CON组(图8a)。

2. STZ诱导1周后DCM组血糖开始升高，整个建模过程中血糖水平始终高于CON组(图8b)。

3. 超声心动图显示，与CON组比较，DCM组EF%、FS%明显降低， LVIDs明显升高。此外，两组间LVIDd略有差异(图8c-h)。

4.与CON组相比，DCM组按体重标准化的心脏重量(HW/BW)和按胫骨长度标准化的心脏重量(HW/TL)均显著增加(P < 0.05，图8i, j)。

八、DCM大鼠Hub MitoDEGs表达的实验验证

1. 使用qRT-PCR检测，与CON组相比，DCM组Pdk4、Hmgcs2、Decr1的表达显著升高，而Ivd在DCM组的表达则显著降低 (上图8k)。

2. 通过蛋白质免疫印迹和免疫组化进一步验证显示，Pdk4、Hmgcs2、Decr1、Ivd蛋白表达水平与mRNA表达水平一致 (上图8l-n)。

九. Hub MitoDEGs与心功能的关系

1. 进一步分析在DCM组和CON组中表达差异明显的四种hub MitoDEGs (Pdk4、Hmgcs2、Decr1和Ivd)与EF%、FS%和LVIDs的相关性。

2. Pdk4的PCR循环数与EF%和FS%呈极显著正相关，但与LVIDs呈极显著负相关;

Hmgcs2 、Decr1的PCR循环数与EF%和FS%呈极显著正相关;

lvd的PCR循环数与EF%和FS%呈极显著负相关，但与LVIDs呈极显著正相关 (图8o)。

总体上，表达上调的Pdk4、Hmgcs2、Decr1和表达下调的DCM心肌组织中的Ivd与心功能降低高度相关。

研究总结：

本研究首次应用线粒体蛋白质组学权威数据库MitoCarta 3.0获取线粒体相关基因，通过综合生物信息学分析，确定了DCM和CON之间线粒体相关基因和免疫细胞浸润的差异；首次发现线粒体代谢与免疫微环境的相互作用，另外，4个枢纽基因Pdk4、Hmgcs2、Decr1、Ivd的筛选和验证为深入探索DCM免疫代谢和探索医学干预的新靶点提供了新的思路。