软件安装
首先从GitHub上下载最新的miRDeep2
git clone https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2.git mirdeep2.0.1.2
cd mirdeep2.0.1.2/
使用install.pl脚本进行安装
perl install.pl
会有如下的提示信息
提示信息
可以按照他的要求，直接使用source ~/.bashrc加载环境变量，然后再次运行perl install.pl就会帮你解决依赖关系，依赖工具如下
数据分析流程
miRDeep2处理数据主要用到了三个脚本: miRDeep2.pl, mapper.pl和quantifier.pl， 需要提供如下的数据集:
- 参考基因组的FASTA文件
- miRBase中该物种的成熟miRNA
- mRBase中该物种的前体miRNA
- 高通量测序结果的FASTA文件
假如你已经有了如下文件
| 文件名 | 描述信息 |
|---|---|
cel_cluster.fa |
参考基因组的FASTA文件 |
mature_ref_this_species.fa |
miRBase中该物种的成熟miRNA |
mature_ref_other_species.fa |
miRBase中该物种邻近物种的成熟miRNA |
precursors_ref_this_species.fa |
mRBase中该物种的前体miRNA |
reads.fa |
高通量测序结果的FASTA文件 |
第一步: 建立索引
bowtie-build cel_cluster.fa cel_cluster
第二步: 将read回帖到参考基因组
mapper.pl reads.fa -c -j -k TCGTATGCCGTCTTCTGCTTGT -l 18 -m -p cel_cluster \
-s reads_collapsed.fa -t reads_collapsed_vs_genome.arf -v
各个参数的含义如下:
- -c: 表示输入文件是fasta，
- -e fastq: 表示输入文件是fastq
- -h 如果不是fasta，用该参数处理成fasta
- -j 移除ATCGUNatcgun以外的字符
- -k: 表示去除接头序列
- -l 18 剔除长度在18 bp以下的序列
- -m 合并相同的reads
- -p bowite索引
- -s 处理后的read
- -t 处理后比对文件
- -d 如果要处理多个样本，则指定配置文件
第三步（可选）: 快速进行定量。如果不需要预测新的miRNA， 可以用直接用miRBase数据库进行定量
quantifier.pl -p precursors_ref_this_species.fa -m mature_ref_this_species.fa \
-r reads_collapsed.fa -t cel -y 16_19
输出结果为miRNA_expressed.csv, 记录每个样本的每个miRNA的count数，结果同样可以用网页打开expression_16_19.html查看
第四步: 鉴定新的miRNA，并进行定量
miRDeep2.pl reads_collapsed.fa cel_cluster.fa reads_collapsed_vs_genome.arf \
mature_ref_this_species.fa mature_ref_other_species.fa \
precursors_ref_this_species.fa -t C.elegans 2> report.log
这一步要求的参考基因组的序列不能有'ATCGN'以外的字符，没遇到报错就万事大吉，遇到报错就用
tr解决吧
第五步: 浏览结果
最后可以打开results.html查看结果。
参考资料
https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2/blob/master/TUTORIAL.md
