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Identification of Diverse Mycovirusesthrough Metatranscriptomics Characterization of the Viromes of Five MajorFungal Plant Pathogens
分析真菌宏转录组寻找病毒
摘要
该研究对五种主要植物病原真菌（Colletotrichum truncatum（2株）, Diaporthe longicolla（3株）, Macrophomina phaseolina（48株）, Rhizoctonia solani（84株）和Sclerotinia sclerotiorum（138株））的275株菌株的total RNA进行深度测序。测序结果展示了植物病原真菌中病毒的多样性和分类，以及病毒与它们的寄主真菌的协同进化等信息。
知识背景
目前人们对真菌病毒的了解不到1%，通过病毒宏基因组（metagenomes，metatranscriptomic viromes）分析是发现真菌病毒多样性的主要渠道。单个真菌病毒对真菌和生态的作用我们知之甚少，因为一个真菌常常有多种病毒感染，很难去单个研究。
随着真菌转录组测序增多，人们对真菌和其病毒的起源和进化了解增多，一些植物内生病毒很有可能来源于真菌病毒，且两者之间遗传物质的交换可能产生新的有害的植物病毒。比如植物病毒Amalgaviridae科病毒通过一种dsRNA真菌病毒和负链RNA（nsRNA）病毒的重组产生。
研究发现一些病毒可以降低真菌致病力（capable of attenuating virulence），可作为防治真菌病害的策略。相同的策略已经被用在治疗人类细菌疾病中，人们利用噬菌体和噬菌体编码的蛋白质（比如内溶素）防治细菌病原菌。同样的，我们也可以考虑用真菌病毒编码的产物，干扰真菌RNA沉默，小RNA代谢和基因表达，从而防治真菌病害。
宏转录组揭示侵染真菌的病毒
1. 文库的构建如下图，使用 Illumina HiSeq2500进行测序。
2. 生信分析首先用trinity软件中k-mers 25和30拼装reads。接下来如下图：
3. qRT-PCR和RACE实验在分析了数据后进行，还用FirstChoice RLM-RACE kit和SMARTer RACE kit确定了tobamo-like和tombus-like病毒的两端，获得了完整序列。
4. 经过以上分析和实验，发现RNA-seq结果获得 0.7×10^8 到3.2×10^8个100nt的paired-end sequence reads。其中0.5%到15.1%显示是病毒源reads。C.truncatum (2 isolates)中2个病毒序列；M.phaseolina (48 isolates)中发现14个序列；D. longicolla中1个；R.solani (84 isolates)中27个；S.sclerotiorum (138 isolates)中28个，一共72个病毒序列，来自15个不同的科。depth为15到247,742-fold，平均20,687-fold，去除mitovirus的reads，平均为7,216-fold。
72个序列中，有五个与Benyviridae, Ophioviridae和Virgaviridae科亲缘关系近，而这三个科之前没有发现过真菌病毒。
检测到的病毒中，73%为ss（+）RNA病毒，15%为dsRNA病毒，12%为nsRNA病毒；49%为线粒体病毒。
针对72个病毒序列的分析和建树
1. Sequences related to members of the Mononegavirales
2. Fusariviridae- andHypoviridae-related sequences.
3. Endornaviridae-related sequences
4. Narnaviridae and Ourmiavirus-related sequences
5. Putative positive-sense single-stranded extramitochondrial RNA virus genomes
6. Putative double-stranded RNA virus genomes
文章中的概念解释
k-mer：是指将一条序列分成包含k个碱基的子字符串，如果reads长度为L，k-mer长度设为k，则产生的k-mers数目为：L-k+1，例如序列AACTGACT，设置k为3，则可以将其分割为AAC ACT CTG TGA GAC ACT共6个k-mers。其中k一定是奇数，如果是偶数遇到回文序列可能会产生完全相同的k-mers。
Mononegavirales：单分子负链RNA病毒目。
这里面很多系统发育分析，很基础很重要的分析内容。一个生物学家说过一句话，写在这篇推送最后吧！
“Nothing in Biology Makes Sense Except in the Light of Evolution.”
——Theodosius Dobzhansky
Marzano, S.-Y.L., Nelson, B.D., Ajayi-Oyetunde, O., Bradley, C.A., Hughes, T.J., Hartman, G.L. et al. (2016) Identification of diverse mycoviruses through metatranscriptomics characterization of the viromes of five major fungal plant pathogens. Journal of virology 90: 6846-6863.
