基因组测序数据的拼接/组装 （图片来源：google）

每一个物种的参考基因组序列（reference genome）的产生都要先通过测序的方法，获得基因组的测序读段（reads），然后再进行从头拼接或组装（英文名称为do novo genome assembly），最后还原测序物种的各条染色体的序列，即ATGC四种碱基的排列顺序。

之所以要进行基因组拼接，是因为现在的测序技术还只能测较短的序列，无法直接获取一整条染色体的序列。如一代测序（Sanger测序）一般可测1kb左右的序列；二代测序（next-generation sequencing），一般可测50~500bp；三代测序虽然可测100kb甚至更长的序列，但现在三代测序技术还不是很成熟，还有较高的测序错误率。

基因组测序数据的从头组装过程，可简单描述为：reads---->contig---->scaffold---->chromosome，具体如下所示：

基因组序列从头组装示意图（图片来源：Guo et al. Genomics, 2017）。首先基因组测序产生reads，然后对reads进行组装产生长片段Contigs，再确定Contig的方向和顺序，组装产生更长的片段Scaffolds，最后再组装连接Scaffold得到完整的染色体序列。

首先，给大家依次介绍一下上图从头拼接中涉及到的两个概念：contig和scaffold。

Contig是由多个reads通过组装而形成的长片段。由于测序读段较短、基因组序列通常含有较多重复序列、而且还有测序错误等原因，除了简单的基因组序列外，大部分物种的基因组序列组装都会先产生很多contig，无法一次获得完整的染色体序列。

Scaffold为多条contig序列连接形成更长片段，这些contig方向和顺序已经确定，且contig间未知序列（一般用NNNN表示）的长度也获知。

Scaffold的获得一般主要通过双端测序（如paired-end sequecing或mate-pair sequencing）来确定contig的顺序和方向，以及contig之间的间隔距离，具体如下示意图所示。

由reads组装产生contig，再由contig连接形成scaffold的示意图 （图片来源：google）

基因组测序数据的从头组装的核心算法主要可以分为以下几大类：

1、基于贪心算法（greedy-extention）；

2、基于Overlap-Layout-Consensus（OLC）；

3、基于de Bruijn Graph；

4、以上两种或多种算法的组合；

5、其他类型。

具体如下图所示：

基因组从头组装算法分类及代表性软件发表的时间（图片来源：Zhanget al. PlosOne, 2011）

其中最经典的两类为：

1）Overlap-Layout-Consensus（OLC）算法，基于OLC算法的组装软件主要是针对长测序读段（如Sanger测序、454测序等）设计的；

2）de Bruijn Graph算法，基于de Bruijn Graph的组装软件则主要是针对二代测序产生的短读段数据设计。

具体如下所示：

1）Overlap-Layout-Consensus（OLC）算法

Overlap-Layout-Consensus（OLC）算法的示意图（图片来源：Ayling et al. Briefings in Bioinformatics, 2019）

2）de Bruijn Graph算法

de Bruijn Graph算法的示意图（图片来源：Ayling et al. Briefings in Bioinformatics, 2019）

现在主流的是二代测序技术，因此再给大家详细介绍一下专门针对二代测序数据开发的基于de Bruijn Graph的从头拼接方法。

其中一个非常著名的软件就是Velvet，是基于de Bruijn Graph设计的经典代表，其算法示意图如下：

Velvet从头组装软件的算法设计示意图（ 图片来源：Zerbinoet al. 2008, Genome Research）。其中红色碱基为测序错误或SNP位点。

Velvet的组装原理，主要可分为这几个步骤：

1）首先把所有测序读段（reads）都分割为更小的片段k-mer；

Reads产生k-mer的过程示意图。这里k为7，假如read的长度为n，则总共可产生n-1个k-mer。

2）把每个k-mer作为一个节点，然后判断k-mer之间是否有k-1碱基的重叠，如果有则作为两个不同的节点连接起来。依次这样连接所有可连接的k-mer就形成了Velvet从头组装软件算法设计示意图中第2步的de Bruijn Graph；

3）依次合并相邻的k-mer，因为相邻的k-mer有k-1个碱基的重叠，就可进一步简化de Bruijn Graph形成Velvet从头组装软件算法设计示意图中第3步的简化后的图；

4）使用一系列算法消除由测序错误而形成的tips（具体如Velvet从头组装软件的算法设计示意图中所示），并合并bubbles（两条或多条路径序列，一般由SNP造成，如Velvet从头组装软件的算法设计示意图）；

5）最后拼接得到Contig序列。

值得注意的是，Velvet从头组装软件算法设计示意图中最后一步拼接产生了回文序列，主要是由于原始序列中含有回文，如果k取为偶数（图中k=4）就容易在组装中形成这种现象。

为了有效的避免拼接中产生回文序列，一般k取为奇数。

那么基于基因组测序数据的从头拼接软件，那些具有较好的性能呢？

不同从头组装软件在拼接C.elegans、Yeast、E.coli、Swinepox基因组时的准确性和覆盖度比较（ 图片来源：Zhanget al. PlosOne, 2011）

从上图中可以看出，Velvet和SOAPdenovo在拼接C.elegans、Yeast、E.coli、Swinepox的基因组序列时，相对于其他软件，组装结果更准确（A：Percentage of correctly mapped contigs）且拼接出来的序列能更完整的覆盖原基因组序列（B：Genome Coverage）。

大部分处理测序数据的软件都是由国外开发的，其中这里提到的SOAPdenovo为华大基因开发的从头拼接软件。