一个做了10年基础研究菜鸟的一点儿心得，希望对喜爱科研又受困于不能做出漂亮结果的菜鸟们有用。
首先，希望我直接给出试剂配制加多少毫升/微克组分，电泳、转膜多大电流电压跑多久的同学请绕道，因为我跑不同的蛋白都会调试相应条件，这是想做好Western的前提--不能死记硬背，墨守陈规！
下面是干货：
1、蛋白样准备。
细胞组织裂解有条件一定要加蛋白酶和磷酸酶抑制剂以及PMSF，保证蛋白的完整。β巯基乙醇一定要加，尤其是有很多亚基的蛋白，只有把亚基间的二硫键破坏，才能得到你的抗体所检测的蛋白多肽。
有条件一定要测定蛋白浓度，不要迷信于基于细胞计数+调内参的Western，事实是在特定处理下，内参的表达也会发生改变（例如PDGF-bb处理就会改变actin）。在这种情况下，只有用蛋白浓度计算得到的上样量才是标准上样量，才能进行横向比较。
测完浓度，计算得到相同上样量所需体积后，一定要保证最后的跑胶样品上样体积和样品中的离子浓度一样（这是你跑出相同宽度完美条带的必要条件）。我一般是蛋白样品+loading，剩余的用裂解液补齐，marker也会补相应的loading。最后总体积不要太大，＜40都是可以的。
2、配胶
玻璃板一定要洗干净，不然到时候胶不匀，跑出来波浪形的条带也不奇怪。要想蛋白分得开，浓度就大一点。如果特别着急，temed是可以多加的，有时候多加1-5都是可以的。液封用异丙醇页面比较整齐，乙醇也是可以的，液封的时候一定要慢，加的太猛会让你的液面一言难尽。上层胶一般2-3厘米左右，反正比梳子长一点就可以。
3、电泳
跑胶之前先用30V左右的小电压跑3-5分钟，让胶里面的离子和电泳液的一致（重要的样用新配的电泳液，不要省）。上样按同体积同离子浓度跑，marker也要加loading，否则最两边的样品会跑歪。
4、转膜（得到好结果的关键步骤）
一定一定要避免气泡！！！气泡主要有两个来源：（1）制作转膜三明治的时候没有赶尽气泡。滤纸和胶，胶和膜，膜和滤纸之间一定要把气泡赶尽，有气泡就会断路，断路蛋白就没法迁移到膜上。（2）从电泳液携带过来的小气泡。一般电泳过的胶不要直接放转膜液里，自来水冲洗一下，把上面的小气泡冲掉，保证开始转膜时转膜液里没有气泡。另外，一层一层放置膜和滤纸时，要先把滤纸或者膜的一边放到胶上，然后缓缓把剩下的滤纸覆盖到胶上，可以避免有气泡。
转膜液回收可以，但记得每次用回收的转膜液补一点儿甲醇，增加降温效果。
5、封闭（没啥好说的）
6、孵一抗
一抗很贵，所以尽量回收。可以用santa的含叠氮钠PBS和BSA配制成5%（m/v）的一抗稀释液，四度放置。一次可以配4-5ml，可以用2-3个月。个人感觉挺划算（ps：用这个方法博士都只用了一支抗体，还没用完）。
一抗的最佳工作浓度要自己测，别迷信说明书，自己设几个浓度梯度1：500，1：1000，1：2000，你会发现有的1：1000的抗体，其实用1：2000效果可能更好。另外，不是抗体越浓越好出条带（1：5000能出的条带，1：1000却一团黑），抗体浓度要摸！！！
7、孵二抗和曝光就没什么好说的了，基本前面的注意了，后面几乎能出出好条带。
暂时想到这么多，大家有不同意见或者更好的方法的，可以说出来大家一起讨论。
供参考。
