Day 1
【1】提蛋白
① 超声<7℃ 预冷，水浴锅100℃ 预热
② 备物（危化柜旁9号冰箱： 上层 蛋白裂解液； 下层 Ck 100x, PS 50x, buffer 5x）
③ 配体系
六孔板 70~80 μL
半个大皿 100μL
一个大皿 400~500μL
例如：半皿B16-OE，半皿B16-WT = 裂解液 200μL + Ck 2μL + PS 4μL （稀释比例不必太严谨），各加100μL
④ 超声
Timer 5min (核蛋白8min)
Pulse 超5s，停5s
功率 50%
⑤ 离心，加buffer (5x)
稍微离心一下，加25μL buffer（此处由于buffer量大，稀释比例要严谨一点）
⑥ 煮蛋白 5min（用一瓶水压着，防止炸开）
【2】配胶
小分子室4℃冰箱：10%浓度试剂盒
大分子室桌面：5mL枪头，架子，上下胶管子
① 去离子水洗用具，检漏
② 配下胶，倒入板中
③ 1 mL无水乙醇封闭（凝固20~30min）
④ 配上胶
⑤ 充分吸去乙醇后，倒入上胶，插梳子【！！！不能有气泡！！！】
⑥ 凝固后泡在蓝色盒子，放回冰箱
Day 2
【3】配液体
① 电泳液1L：甘氨酸Glycine + Tris + SDS（大分子室架子）
[1x] Glycine 18.8g，Tris 3.02g，SDS 1g
[5x] Glycine 94g，Tris 15.1g，SDS 5g
② 快速转膜液： 1000mL配方：100mL快转液（10X）+ 800mL去离子水 + 100mL无水乙醇（或甲醇）
每次配1.5L： 150mL快转液 + 1200mL去离子水 + 150mL无水乙醇
【4】上样
① 拔梳子，去离子水清洗浮沫
② 插入槽中，加电泳液
③ 样品振荡后上样，默认 7μL（后续根据内参调整），marker 3μL
【5】电泳
红对红，黑对黑
① 浓缩胶：50~80V
② 分离胶：100~120V
看电流调电压（恒流）：1块胶→20mA，2块胶→40mA，3块胶→50mA，4块胶→60mA
[恒压]
如在整个电泳过程中电压保持恒定，则电流和功率（热量）会随着电阻的增加而降低，同时导致运行时间增加，而蛋白条带有更多的时间扩散。但随着温度的降低，扩散速率随温度的降低也会抵消掉这一点。当并行运行多个凝胶时，通常首选使用恒电压，以确保凝胶上施加的电压是明确可控的。
[恒流]
如果电泳期间电流保持恒定，那么电压、功率及凝胶的热量则在运行期间增加。恒流运行比恒压运行时间短但凝胶温度高。热量的增加加快了蛋白条带的弥散速度，如不进行额外制冷，会导致条带的弥散。
【6】切胶转膜
搪瓷盆里放转膜液，浸润胶；小心撬开板子（撬开一角，忘里面送水，利用张力轻柔撕开）
可准备一个15mL离心管（用于湿润和赶气泡）
① 夹子黑色面浸泡在转膜液
② 切胶，剪膜（右上角剪角并标记，泡在甲醇中）
③ 切下的胶转移到滤纸上，覆盖膜
④ 赶气泡【最最最重要】
此方法转膜后，蛋白位于膜与胶紧贴的一面（操作时俯视观察到的为反面，如下图）
【7】转膜
恒流400mA，按下述时间可将 150kDa 大小转完，若＞150kDa 则延长5~10min
6% 15min
7.5% 20min
10% 30min
12% 35min
【8】封闭
5% 脱脂奶粉：1g脱脂奶粉 + 20mL TBST
28慢摇，1h
封闭完不洗
【9-1】孵育一抗
4℃冷库，摇过夜
Day 3
【9-2】漂洗
TBST 80快摇，4~5次，每次5~10min
【10】孵育二抗
① 加入二抗，28慢摇 1h
② TBST 80快摇，4~5次，每次5~10min
【11】发光
洗完未能及时发光可 泡在TBST，放回4℃冰箱
发光仪房间配置发光液【注意避光】，条带浸没数秒即可发光
发光位置：
① Eblot：正面朝下（剪角在右上方）
② 另一台：正面朝上（剪角在左上方）
