一、引言｜RNA世界的新纪元
RNA，作为连接遗传信息与功能执行的关键分子，早已不再只是DNA到蛋白质的“信使”。近年来，大量研究表明，RNA分子的转录起始、剪接变异、poly(A)尾长度以及化学修饰共同构成了高度动态、复杂调控的“转录组景观”。正因如此，RNA测序（RNA-seq）已成为揭示基因调控、疾病机制与生物复杂性的核心技术之一。
然而，当前主流的RNA测序技术，如Illumina平台的二代短读长测序，依赖于逆转录和PCR扩增，不可避免地引入了序列偏倚、定量误差，甚至会错失重要的RNA修饰信息。此外，短读长拼接重构全长转录本仍存在算法局限，特别是在多重剪接和融合转录本研究中尤为突出。
Direct RNA-seq（直接RNA测序，简称DRS）由Oxford Nanopore Technologies（ONT）推出，首次实现了在不经逆转录、不依赖扩增的条件下，直接测序天然RNA分子的能力。该技术不仅保留RNA分子的天然序列信息，还可同步获取其poly(A)尾长度和修饰状态，为解析真实转录组提供了前所未有的视角。
我们正处在一个从“看懂转录”到“读懂RNA”的新纪元。
而Direct RNA-seq，正是打开这个新时代的关键钥匙。本文旨在深入探讨DRS的技术原理、应用场景及其在现代生命科学研究中的独特价值，以期为科研人员提供全面的参考。
二、技术原理｜直读RNA，不经转录
在传统RNA测序中，RNA分子必须先被逆转录为cDNA，并经过PCR扩增，才能进入测序流程。这一过程中，许多关键的原始信息被丢失或扭曲，例如RNA上的化学修饰、poly(A)尾的真实长度，以及剪接体间的微妙差异。DRS则打破了这一壁垒。
■工作原理概览
DRS利用 Oxford Nanopore 的纳米孔技术，通过检测RNA分子通过纳米孔时产生的电流变化，实现对天然RNA的实时测序。具体流程如下（见图1）：
1. Poly(A)+ RNA富集：从总RNA中选择含poly(A)尾的mRNA；
2.接头连接：将适配接头连接至RNA 3'端，方便电动驱动及酶复合物装载；
3.马达酶引导测序：马达酶（Motor Protein）将RNA分子缓慢推进穿过纳米孔；
4.电信号采集与解码：纳米孔读取每个核苷酸通过时的电流信号，软件将其解码为碱基序列；
5.同时获取RNA修饰与poly(A)长度信息：由于未逆转录，修饰保留在原始分子上，poly(A)尾长度亦可直接从信号模式中推算。
✅全流程不经逆转录，不经扩增✅信号源来自原始RNA，最大程度保留生物信息原貌
三、技术优势｜重构转录组的七大突破
Direct RNA-seq（DRS）从分子本体出发，绕开逆转录和扩增步骤，以单分子、原位测序的方式提供一系列独特信息维度。相比cDNA-based RNA测序技术，DRS在以下七个方面具备显著优势：
1.直接检测RNA修饰
纳米孔测序可识别RNA分子通过孔道时产生的微弱电流变化，这使得DRS具备从原始信号中识别天然修饰（如m6A、m5C、Ψ等）的能力。与抗体富集或化学标记相比，该方法无需额外实验步骤、不依赖序列上下文，更适合进行全转录组范围内修饰图谱绘制。
技术亮点：
• 基于深度学习模型可定位单碱基分辨率修饰
• 可同时识别多种修饰类型
• 数据来源更接近生理状态
2.精准测量poly(A)尾长度
DRS独特的电信号可用于精确识别RNA 3′端腺苷链的长度，达到单分子、原位、无酶依赖的poly(A)长度测量。这为研究RNA稳定性、转录后调控及RNA衰变路径提供了可靠参数。
技术亮点：
•无需tailing或酶切修饰
• 同步获取序列与尾长信息
• 适用于动态体系与多异构体比较
3.识别融合转录本
DRS输出单条完整的RNA长读长，天然跨越剪接和重排结构，可清晰解析染色体重排产生的融合转录本或转录跳跃事件，避免短读长技术中因拼接算法失误带来的假阳性。
技术亮点：
•可定位融合位点与两侧结构
• 精准判断转录单位完整性
• 对参考基因组依赖更低，适合未充分注释区域
⭐4.全长转录本结构解析
无需拼接重构，DRS可直接输出覆盖完整5′-UTR、CDS至3′-UTR区域的原始读段，有效捕获复杂剪接变体、保留异构体结构，适用于研究组织特异性表达与调控多样性。
技术亮点：
•保留天然剪接事件全貌
• 解析复杂的多重异构体
•显著提升isoform层级解析能力
⭐5.无需逆转录与PCR扩增
DRS跳过RT和PCR步骤，避免了扩增偏倚、酶切误差和模板选择偏好，更真实反映RNA表达量与结构。对富含二级结构的RNA分子、GC含量极端或低表达转录本特别友好。
技术亮点：
• 表达定量更准确
•无扩增假剪接、TSO artifact
• 兼容非聚腺苷化或非编码RNA
⭐6.发掘新基因与新转录本
借助长读长与无参考拼接能力，DRS可直接识别未注释区域的活跃转录事件，包括novel transcript、intergenic RNA与重定位表达单位，适用于非模式物种或肿瘤异质性分析。
技术亮点：
• 低注释背景下的de novo能力强
• 适合泛转录组注释与表达图谱构建
•跨物种、跨组织一致适用
⭐7.原始电信号数据可扩展挖掘
DRS保留每条RNA分子的原始纳米孔电流轨迹，为机器学习模型提供了“可训练”的原子层级信号空间。该特性为未来探索未知修饰、结构、翻译信号等潜在生物特征提供了丰富素材。
技术亮点：
• 支持自定义修饰识别模型开发
• 可用于新功能RNA的信号追踪
• 与AI/ML算法深度兼容，具备前瞻性拓展空间
四、应用场景｜从基础研究到转化前沿
1.表观转录组学：单分子单碱基分辨率揭示RNA修饰的功能与机制
RNA分子除了携带遗传信息外，还通过一系列复杂的化学修饰来扩展其功能和调控潜力，这些修饰统称为“表观转录组学”。目前已发现的RNA修饰种类超过170种，其中N6-甲基腺苷（m6A）、5-甲基胞嘧啶（m5C）和假尿苷（ψ，Pseudouridine）是研究最为广泛且功能重要的修饰。传统检测RNA修饰的方法往往依赖于抗体富集（如meRIP-seq）、化学处理或间接推断，这些方法通常需要大量起始材料，分辨率有限，且无法在单分子水平上同时识别修饰类型和位置。Nanopore direct RNA sequencing (DRS) 技术通过检测RNA分子通过纳米孔时电流信号的微小变化，能够直接识别多种RNA修饰，并在单分子、全长转录本水平上提供修饰位点和丰度信息，极大地革新了表观转录组学研究。
（1）N6-甲基腺苷 (m6A) 修饰的单分子分析
m6A是真核生物中最常见且最丰富的mRNA内部修饰，在mRNA的剪接、稳定性和翻译等多种生物学过程中发挥着关键作用。DRS通过分析电流信号的特征，能够直接识别RNA链上的m6A修饰，无需额外的化学处理或抗体富集步骤，从而提供无偏倚的修饰图谱。
例如，2024年发表在《Nature Microbiology》的研究利用Nanopore DRS对全长HIV-1 RNA进行了单分子水平的表观转录组学分析[1]。这项研究的关键之处在于：
• 高分辨率m6A景观绘制：DRS能够提供HIV-1 RNA上m6A修饰的高分辨率图谱，揭示了病毒RNA上的修饰景观，突出显示了三个主要m6A位点。
• m6A功能冗余性揭示：通过分析带有不同m6A组合的全长DRS读段，研究发现，尽管某个特定m6A位点发生突变，其他m6A位点仍能发挥功能冗余性。例如，研究展示了单突变和三突变HIV-1 RNA的全长DRS读段的m6A分析，发现即使在单目标位点去除m6A修饰后，转录本表达和剪接没有显著变化。这表明m6A修饰可能存在功能冗余性或代偿机制。
• m6A对剪接调控的洞察：更重要的是，该研究揭示了m6A修饰与HIV-1 RNA剪接之间的复杂关系。DRS能够同时捕获m6A修饰信息和转录本剪接模式，使得研究人员能够在单分子水平上关联m6A修饰状态与特定的剪接异构体，从而揭示m6A如何影响病毒的基因表达。
（2）5-甲基胞嘧啶 (m5C) 修饰的直接检测
m5C是mRNA和非编码RNA上另一种重要的修饰，参与RNA的稳定性、翻译和结构形成。传统上，m5C的单碱基分辨率检测常依赖于亚硫酸氢盐测序，但该方法可能导致RNA降解并产生偏差。DRS的直接测序特性使其成为识别m5C的有力工具。
2024年发表在《Cell Death & Disease》的研究就利用Nanopore direct RNA测序技术来研究乙型肝炎病毒（HBV）转录本上的m5C修饰[2]。这项研究的亮点在于：
• HBV mRNA上m5C位点的鉴定：通过DRS，研究人员成功鉴定出HBV mRNA上具有功能性的m5C位点。这为理解HBV病毒复制和宿主免疫逃逸的分子机制提供了新的视角。
• m5C对病毒复制和免疫逃逸的促进作用：该研究发现，HBV mRNA上的m5C修饰不仅对于Aly/REF输出因子识别以促进病毒mRNA输出和HBx翻译至关重要，而且对于抑制RIG-I结合以抑制干扰素-β（IFN-β）的产生也必不可少。DRS的单分子分辨率使得研究人员能够直接观察到m5C修饰如何影响病毒RNA的命运和与宿主蛋白的相互作用。
（3）假尿苷 (ψ) 修饰的无偏倚分析
假尿苷（ψ）是RNA中最普遍的异构化修饰，通常由假尿苷合酶催化，将尿苷异构化为假尿苷。ψ修饰能够影响RNA的二级结构、稳定性、与蛋白质的相互作用以及翻译效率。由于ψ修饰不改变碱基的化学组成，其检测比甲基化修饰更具挑战性。然而，DRS能够识别由ψ修饰引起的纳米孔电流信号变化。
2024年发表在《Cancer Research》的研究就利用Nanopore DRS来研究癌症发展过程中mRNA假尿苷化的作用[3]。这项研究揭示了：
• MYC驱动的mRNA假尿苷化：研究发现MYC促癌基因能够转录性地上调假尿苷合酶PUS7的表达。通过DRS，研究人员能够观察到MYC驱动的细胞中mRNA假尿苷化水平的提高。
• 假尿苷化对mRNA翻译的调控：更重要的是，DRS能够用于分析特定mRNA（如MCTS1 mRNA）上的假尿苷化位点，并进一步揭示假尿苷化如何增强MCTS1 mRNA的翻译。MCTS1是一种非经典翻译起始因子，它驱动应激诱导的ATF4表达。DRS提供的直接修饰信息使得研究人员能够将RNA修饰与翻译效率和细胞应激反应联系起来，揭示癌细胞通过调控RNA修饰来适应增殖压力并促进肿瘤发展的分子机制。
综上所述，Nanopore DRS技术在RNA修饰分析方面展现出其革命性潜力。它能够在单分子水平上直接识别并量化m6A、m5C、ψ等多种重要的RNA修饰，并同步获取全长转录本的序列和丰度信息。这种整合性的分析能力极大地促进了对表观转录组学复杂性的理解，是探索基因表达调控、疾病机制以及开发新型治疗策略的强大支柱。
2.复杂转录结构解析：精准识别剪接异构体与融合转录本
Nanopore direct RNA sequencing (DRS)技术因其能够直接测序全长RNA分子而无需逆转录和PCR扩增，极大地提升了转录本结构解析的准确性和完整性。这使得DRS在精准识别剪接异构体和融合转录本方面展现出传统短读测序技术无法比拟的优势，为基因表达研究和疾病诊断提供了重要的工具。
（1）精准识别剪接异构体
基因的复杂性很大程度上来源于可变剪接，同一个基因通过不同的剪接方式可以产生多种剪接异构体，这些异构体可能在功能上存在显著差异。传统短读测序技术由于读长限制，往往难以准确捕获全长转录本的剪接模式，尤其是在存在复杂剪接事件或转录本较长的情况下。DRS技术通过一次性读取完整或接近完整的RNA分子，能够清晰地展示不同外显子之间的连接关系，从而实现对剪接异构体的全面和精准识别。
例如，一项2025年发表在《Nature Methods》的研究系统性地评估了Nanopore长读长RNA测序在人类细胞系中转录本水平分析的能力[4]。该研究通过对七种人类细胞系进行多种RNA测序方案的分析，发现Nanopore DRS能够更稳健地识别主要剪接异构体。这项工作充分展示了DRS在揭示复杂剪接多样性方面的强大潜力，为理解基因功能的多样性提供了关键数据。通过捕获完整的转录本信息，DRS能够识别出短读长技术可能遗漏的低丰度或复杂剪接事件，例如外显子跳跃、内含子保留、可变剪接位点使用等，从而更全面地描绘细胞内的转录组图谱。
此外，2024年发表在《Proc Natl Acad Sci U S A》的研究进一步展示了DRS在特定生物学情境下剪接异构体研究的应用[5]。该研究利用Nanopore测序技术（FLEP-seq2）分析了拟南芥幼苗在不同光照条件下的核RNA，发现了大量光响应的转录后剪接（PTS）内含子。这种内含子在细胞核内以未剪接的形式存在，并在特定条件下被快速剪接，从而实现对环境信号的快速响应。DRS的全长测序能力使得研究人员能够直接检测并量化这些内含子的保留与剪接状态，揭示了植物通过精细调控剪接过程来适应环境变化的机制。这表明DRS不仅能识别已知的剪接异构体，还能够发现新型的剪接调控模式，对于理解基因表达的动态调控具有重要意义。
（2）发现融合转录本
融合转录本是由两个或多个原本不相邻的基因片段异常连接而形成的嵌合RNA分子，它们常常与癌症等疾病的发生发展密切相关。由于融合转录本通常涉及跨染色体或长距离基因组区域的重排，传统短读测序技术在检测这些事件时面临挑战，容易产生假阳性或遗漏真实的融合事件。DRS技术能够一次性测序跨越融合断点的长RNA分子，从而提供直接且高置信度的证据来识别融合转录本。
在上述《Nature Methods》2025年的研究中[4]，除了剪接异构体的分析，SG-NEx数据（包含Nanopore长读长测序数据）还能够用于识别融合转录本，作者在研究中共识别了106个融合基因。DRS的优势在于其能够跨越较长的基因组距离，直接捕获融合基因的完整转录本。这种全长信息对于确认融合事件的真实性、确定融合断点以及评估融合基因的结构特征至关重要。通过对全长RNA的直接读取，DRS可以有效避免短读长测序中因片段化而导致的假阳性结果，并能发现低丰度的融合转录本，为癌症诊断、预后判断和靶向治疗提供了更精准的分子标记。
Nanopore DRS技术凭借其独特的全长RNA测序能力，在转录结构解析方面展现出巨大的潜力。无论是对复杂剪接异构体的全面识别，还是对疾病相关融合转录本的精确检测，DRS都提供了前所未有的分辨率和准确性，极大地推动了我们对转录组复杂性的理解，并为基础研究和临床应用开辟了新的途径。
3.转录本定量与poly(A)尾分析
Nanopore direct RNA sequencing (DRS)技术不仅能提供全长转录本的结构信息，其直接读取RNA分子的特性也使其在转录本的精确定量以及关键的poly(A)尾长度分析方面展现出独特优势。这些能力对于深入理解基因表达调控机制至关重要。
（1）精准转录本定量
传统短读测序技术在转录本定量时，由于读长限制，常常需要依赖基因注释和复杂的计算模型来推断全长转录本的丰度。这在面对可变剪接异构体或新转录本时，容易引入偏差。Nanopore DRS技术通过直接测序全长RNA分子，能够直接获取每个转录本的完整序列信息，从而实现更精准的转录本定量。
例如，2025年发表在《Advanced Science》的研究充分展示了DRS在转录本定量方面的强大能力[6]。该研究利用DRS技术分析了小鼠在禁食和进食状态下多个主要器官的组织特异性RNA图谱。研究发现，Nanopore DRS能够揭示数万个新型转录本，并识别数百个具有组织特异性表达的基因。这些发现揭示了传统短读长RNA测序无法解析的每个器官内额外的调控通路层级。
更重要的是，通过对同一条件下多器官转录本表达的分析，该研究进行了比较分析，揭示了转录本异构体和调控的显著差异。DRS的全长测序能力使得研究人员可以直接量化这些新型和已知转录本的丰度，避免了短读长技术因片段化和注释不完整导致的定量误差。这种对全长转录本的直接定量，为深入理解复杂生物学过程中的基因表达动态提供了更为准确和全面的数据。
（2）精准poly(A)尾长度分析
真核生物信使RNA (mRNA)的3'端通常带有一段由腺苷酸组成的poly(A)尾。poly(A)尾的长度是一个重要的转录后调控因子，它影响mRNA的稳定性、翻译效率以及亚细胞定位。传统方法对poly(A)尾长度的分析通常需要复杂的实验步骤或间接推断，且分辨率有限。Nanopore DRS的独特之处在于它能够直接测序到mRNA的poly(A)尾，从而实现对poly(A)尾长度的精确测量，这为研究基因表达的转录后调控提供了革命性的工具。
上述《Advanced Science》2025年的研究进一步强调了Nanopore DRS在poly(A)尾分析方面的优势[6]。该研究指出，Nanopore DRS能够揭示转录本poly(A)尾长度和m6A修饰的动态变化。在小鼠禁食和进食的生理条件下，研究人员能够观察到不同器官中基因表达如何通过poly(A)尾长度的改变被调控。这种直接的、高分辨率的poly(A)尾长度测量，使得研究人员能够更深入地探讨：
• 生理状态对poly(A)尾长度的影响：例如，在禁食与进食的代谢转换过程中，特定基因的poly(A)尾长度可能发生变化，进而影响其mRNA的稳定性和翻译效率，从而调控细胞和组织的生理响应。
• 组织特异性poly(A)尾长度调控：不同组织在相同刺激下，其基因的poly(A)尾长度调控可能存在差异，这有助于解释组织特异性功能。
另一项2022年发表在《Cell Reports》的研究则更深入地探讨了Nanopore DRS在特定基因poly(A)尾长度调控机制研究中的应用[7]。该研究聚焦于TOP (Terminal Oligopyrimidine) mRNA，这类mRNA编码核糖体蛋白和其他翻译相关因子，其翻译受mTOR信号通路的高度调控。研究人员利用Nanopore direct RNA sequencing 全面分析了TOP和非TOP mRNA的poly(A)尾长度。
该研究的重要发现包括：
•TOP mRNA poly(A)尾长度与核糖体加载呈正相关：研究表明，TOP mRNA的poly(A)尾长度与核糖体加载（即翻译效率）之间存在显著的正相关关系。长poly(A)尾通常与更高的翻译效率相关联。
• poly(A)尾长度随mTOR活性动态波动：Nanopore DRS数据显示，TOP mRNA的poly(A)尾长度会随mTOR活性的变化而动态波动。在mTOR被激活时，TOP mRNA的poly(A)尾变长；当mTOR活性受到抑制时，poly(A)尾则缩短。
• LARP1在维持长poly(A)尾中的作用：研究进一步揭示了RNA结合蛋白LARP1在mTOR慢性失活条件下维持TOP mRNA长poly(A)尾的重要性。通过DRS，研究人员能够直接观察到LARP1如何通过影响脱腺苷化过程来保留TOP mRNA的较长poly(A)尾，从而在mTOR重新激活时促进翻译的快速恢复。
这些发现突显了Nanopore DRS在解析复杂的转录后调控网络中的独特优势。通过直接、高分辨率地测量poly(A)尾长度，DRS为研究mRNA的命运、翻译调控以及细胞对外界刺激的响应机制提供了前所未有的洞察力。
Nanopore DRS技术在转录本定量和poly(A)尾分析方面的应用，极大地拓展了我们对基因表达调控的理解。其直接测序全长RNA的能力，不仅提升了转录本定量的准确性，更使得对poly(A)尾长度的测量成为可能，为深入探索复杂的生物学过程提供了强大的工具。
4.非编码RNA的解析
近年来，非编码RNA (ncRNA)的研究日益成为基因表达调控领域的热点。其中，长链非编码RNA (lncRNA) 和环状RNA (circRNA) 因其独特的结构和多样的功能，在疾病发生发展、细胞分化、发育等诸多生物学过程中发挥着关键作用。然而，由于这些非编码RNA的丰度通常较低，且结构复杂，传统测序技术在对其进行全面精准的识别和分析时面临挑战。Nanopore direct RNA sequencing (DRS) 技术凭借其长读长和直接测序的特性，为lncRNA和circRNA的研究提供了革新性的技术手段。
（1）长链非编码RNA (lncRNA) 的全面识别与解析
lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA分子，它们不编码蛋白质，但通过多种机制参与基因表达调控。由于lncRNA的转录本通常结构复杂，且缺乏poly(A)尾（约有20%的lncRNA是非poly(A)化的），传统基于poly(A)富集的短读长测序方法往往难以对其进行全面捕获和精确分析。Nanopore DRS能够直接测序RNA分子，全面覆盖包括非poly(A)化lncRNA在内的各类非编码RNA。
2024年发表在《Genome Biology》的研究针对这一挑战，开发了一种名为NERD-seq (Non-Enriched RNA Direct Sequencing) 的新型Nanopore direct RNA测序方法[8]。这项研究的重点在于扩展非编码RNA的研究范围。通过片段分选、加poly(A)尾等步骤，NERD-seq能够更广泛地捕获细胞中更多类型的RNA，包括那些不含poly(A)尾的lncRNA。研究结果显示，与标准DRS方法相比，NERD-seq在捕获非poly(A)化RNA方面表现出显著优势。例如，在人类HEK293细胞和C57BL/6小鼠大脑样本中，NERD-seq提高了非聚腺苷化RNA的检测率，并增加了这些RNA的测序深度。这使得研究人员能够更全面地识别和定量各种lncRNA，包括那些传统方法难以检测到的新型或低丰度的lncRNA，从而为深入理解lncRNA在生物学过程中的复杂功能奠定基础。
（2）环状RNA (circRNA) 的精准发现与功能研究
circRNA是一类特殊的非编码RNA，其两端通过共价键连接形成环状结构，使其不易被核酸外切酶降解，从而表现出更高的稳定性和更长的半衰期。circRNA不具有线性的5'帽和3'poly(A)尾，这使得传统的mRNA测序方法难以对其进行有效捕获。Nanopore DRS的长读长特性在circRNA研究中具有独特优势，因为它能够跨越其独特的“反向剪接”位点，从而实现circRNA的精确鉴定和其全长结构的解析。
2023年发表在《Science Advances》上的研究就充分利用了Nanopore direct RNA测序技术来研究circRNA在HIV-1感染中的作用[9]。该研究通过DRS捕获了HIV-1感染的T细胞中的circRNA。通过这种方法，研究人员成功鉴定了一种新型的环状RNA，命名为ciTRAN，并发现其能够调节HIV-1的转录。这项研究的重要发现包括：
[if !supportLists]• [endif]ciTRAN的精确鉴定与结构解析：DRS能够直接读取ciTRAN的完整环状结构，并精确定位其反向剪接位点。这对于确定circRNA的基因起源和剪接模式至关重要。
[if !supportLists]• [endif]ciTRAN表达与HIV-1 Vpr的关联：研究发现，HIV-1感染能够以Vpr依赖的方式诱导ciTRAN的表达。DRS提供的全长信息有助于研究人员将ciTRAN的表达与特定病毒蛋白的功能联系起来。
[if !supportLists]• [endif]ciTRAN在病毒转录中的调控作用：通过DRS，研究人员能够深入探讨ciTRAN如何与SRSF1（一种已知的HIV-1转录抑制蛋白）相互作用，从而防止病毒前病毒的转录抑制。这种直接的RNA-RNA或RNA-蛋白相互作用的机制研究，得益于DRS对全长转录本的捕获能力，使得能够更全面地理解circRNA在病毒-宿主相互作用中的复杂角色。
因此，Nanopore DRS技术在lncRNA和circRNA研究中展现出其不可替代的优势。通过拓展长链非编码RNA的捕获范围，并提供对环状RNA全长结构的精确解析，DRS为深入探索这些重要非编码分子在基因调控网络中的功能和作用机制提供了强有力的支持，极大地推动了非编码RNA领域的研究进展。
5.新转录单元与基因组注释
尽管高通量测序技术已经极大地推动了基因组学的研究，但当前大部分的基因组注释仍然不完整，尤其是在转录本水平。许多基因可能存在未被识别的新型转录本异构体、转录起始位点或终止位点，甚至全新的基因。传统短读测序由于读长有限，难以准确识别这些“隐藏”的转录单元，往往需要依赖现有注释进行推断。Nanopore direct RNA sequencing (DRS) 技术凭借其长读长和直接测序的优势，能够提供全长转录本信息，从而在发现新转录单元和完善基因组注释方面发挥关键作用。
（1）新型转录本与基因的发现
DRS能够直接捕获完整的转录本序列，包括其5'端和3'端，这使得它在鉴定新型转录起始位点（TSS）、转录终止位点（TTS）以及新的可变剪接事件方面具有独特优势。通过不依赖于现有注释的比对，DRS能够识别出完全未被注释的转录本，甚至推断出新型基因。
例如，2024年发表在《Genome Research》的研究就展示了DRS在发现新型基因和转录本方面的应用[10]。该研究将DRS和PCR cDNA测序（PCS）应用于肾透明细胞癌（ccRCC）的存档组织样本，旨在发现与疾病复发和免疫逃逸相关的新型转录本和基因。尽管存档样本的RNA质量可能受损，导致平均读长较低（约400-500bp），但DRS仍然展现了其价值：
[if !supportLists]• [endif]识别大量新型转录本和基因：研究人员利用DRS从这些临床样本中鉴定出了大量新型基因和转录本，这些在公共数据库（如GENCODE）中均未被注释。
[if !supportLists]• [endif]发现与疾病相关的特定转录本：通过对复发和非复发ccRCC患者样本的比较分析，该研究发现与ccRCC复发和免疫逃逸相关的新型转录本和基因。这些发现为疾病的早期诊断、预后判断和靶向治疗提供了潜在的生物标志物和作用靶点。这表明DRS能够超越现有的基因组注释，揭示与疾病状态密切相关的新型分子。
前面提到的2025年发表在《Advanced Science》的研究也强调了DRS在发现新型转录本方面的能力[6]。该研究利用DRS分析了小鼠多个器官在禁食和进食条件下的RNA图谱，结果表明，Nanopore DRS能够揭示数万个新型转录本。这些新型转录本的发现进一步证明了哺乳动物基因组中转录组复杂性远超现有注释的范围，而DRS正是揭示这种复杂性的关键工具。
（2）完善基因组注释
DRS捕获的全长转录本信息可以直接用于修订和完善基因组注释。通过将全长读长比对到基因组上，可以精确地确定转录本的边界（包括TSS和TTS），验证已注释的剪接位点，纠正错误的基因模型，并添加新的异构体信息。这对于构建更准确、更全面的基因组和转录组参考数据库至关重要。
2025年发表在《Nucleic Acids Research》的研究提供了一个典范案例，展示了DRS如何用于全面提升模式生物的基因组注释水平。该研究通过整合深度的表观遗传学和转录组学数据，包括Nanopore direct RNA sequencing数据，对模式纤毛虫嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）进行了综合基因组注释[11]。
• DRS在转录本边界识别中的应用：研究人员利用Nanopore DRS数据来识别精确的转录起始位点（TSS）和转录终止位点（TTS）。由于嗜热四膜虫的转录本通常无内含子且结构相对简单，DRS的长读长能够直接覆盖整个基因编码区和UTR（非翻译区），从而提供比短读长测序更精确的转录本边界信息。
• 验证和修正现有注释：DRS的全长数据被用于验证和修正现有的基因模型和注释。通过比对DRS读长与预测的基因模型，研究人员能够纠正潜在的注释错误，并识别出此前未知的转录本异构体。
• 构建高质量的注释数据库：最终，这些DRS数据与其他高通量测序数据（如染色质可及性、组蛋白修饰等）的整合，极大地提高了嗜热四膜虫基因组的注释质量和完整性，构建了一个高质量的转录组和基因组注释数据库。这对于研究嗜热四膜虫的基因调控、染色质生物学以及作为模式生物的广泛应用具有里程碑意义。
这些研究共同证明，Nanopore DRS技术是发现和验证新型转录单元、纠正现有基因模型以及构建更精确、更全面的基因组注释的强有力方法。随着测序技术的不断进步和成本的降低，DRS将在未来基因组学和转录组学的研究中扮演越来越重要的角色。
6.动态转录图谱监测：结构、表达量与修饰变化的同步洞察
生物系统是高度动态的，其转录组在生理变化、环境刺激或疾病进展过程中会发生复杂而迅速的响应。为了全面理解这些动态变化，需要一种能够同时捕捉转录本结构、表达量和转录后修饰信息的技术。Nanopore direct RNA sequencing (DRS)技术因其能够在一个测序流程中直接读取RNA分子，并同时提供全长序列、丰度信息以及潜在的碱基修饰信号，成为观察和解析动态转录图谱的理想工具，尤其适用于研究对象在受影响前后的连续检测。
（1）整合多维度信息，全面解析动态响应
传统测序方法通常需要多个独立的实验流程来获取转录本结构（如短读长RNA-seq）、表达量（如定量RT-qPCR）和RNA修饰（如m6A meRIP-seq）数据。这不仅增加了实验的复杂性和成本，也可能因不同实验流程间的差异而引入偏差。DRS的“一站式”解决方案克服了这些限制，能够从单个实验中提供对转录组的全面动态视图。
例如，2024年发表在《Nature Communications》的研究充分展现了DRS在动态转录图谱观察方面的强大能力[12]。该研究对SpaceX Inspiration4任务的四名宇航员在七个时间点（包括飞行前、返回当天和飞行后恢复期）的血样进行了纵向的全血长读长直接RNA测序。这项研究的关键优势在于：
• 实时捕捉生理应激下的转录组动态：宇航员经历的太空飞行是极端的生理应激事件。DRS能够定量映射化学结构和表达水平的变化，从而揭示太空飞行对人体生理，特别是造血和免疫系统，在分子和细胞层面的影响。研究报告了关键基因通路的改变，包括红细胞调节、应激诱导和免疫变化的动态。
• 同步检测基因表达与m6A修饰变化：这是首次在宇航员血液中进行基于纳米孔的直接RNA测序，也是首次报告太空飞行相关的m6A RNA修饰增加。DRS的独特能力使其能够在同一测序数据中同时识别转录本的表达量变化和N6-甲基腺苷（m6A）修饰的变化。研究发现太空飞行导致m6A修饰的增加，这可能调控了血液系统细胞的转录响应，表明DRS能够提供整合的转录后调控信息。这种同步观察的能力对于理解复杂的生物学机制至关重要，因为基因表达的调控往往涉及多层面的协同作用。
（2）揭示细胞应激响应中的RNA衰变机制
细胞在面临压力时会迅速调整其基因表达程序，其中RNA的稳定性（衰变）是关键的调控环节。DRS可以追踪mRNA分子从完整状态到降解产物的全过程，从而揭示在细胞应激条件下mRNA衰变的动态模式和相关机制。
2024年发表在《eLife》的研究则进一步利用全长DRS来揭示细胞应激下的mRNA衰变机制[13]。这项研究的重要发现挑战了传统观念：
• 识别应激颗粒依赖的mRNA缩短：研究发现，细胞在应激反应中会触发一系列通路，导致mRNA的广泛改变。通过全长DRS，研究人员观察到在细胞应激状态下mRNA会发生显著的缩短。令人惊讶的是，这种mRNA的缩短并不需要poly(A)尾的缩短。
• 揭示mRNA降解的新范式：传统认为mRNA降解始于poly(A)尾的缩短。然而，DRS的精确全长读取能力使得该研究能够发现一种新的mRNA衰变过程，即应激颗粒依赖的RNA衰变。这种衰变模式似乎独立于经典的poly(A)尾缩短途径，揭示了细胞如何通过将mRNA转移到应激颗粒中来促进其降解，从而实现对基因表达的快速调控。
这些研究共同证明，Nanopore DRS技术在观察生物体在动态变化中的转录图谱方面具有无可比拟的优势。它能够在一个实验中同时提供转录本结构、表达量和多种RNA修饰信息，极大地提升了我们对复杂生物学响应机制的理解，为探索疾病发生发展、环境适应以及生理应激等过程中的分子事件提供了全面而深入的视角。
五、独特定位｜DRS的核心价值
Nanopore direct RNA sequencing (DRS)作为一项新兴的测序技术，在转录组学研究中展现出独特的优势。其直接读取RNA分子的能力，使其在多个方面超越了传统的转录组测序方法，并在RNA修饰分析领域开辟了新途径。本节将从与其他转录组测序技术的比较以及在RNA修饰检测方面的独特性两个维度，深入阐述DRS的优势。
（1）与其他转录组测序技术的比较：全长、无偏倚的转录本图谱
传统的转录组测序方法，如短读长RNA-seq和基于cDNA的长读长测序（如Nanopore cDNA测序和PacBio Iso-seq），各有其应用场景和技术局限。短读长RNA-seq因其高通量而广泛应用，但难以解析全长转录本结构；而基于cDNA的长读长测序虽然提供了全长信息，但不可避免地引入了逆转录和PCR扩增带来的偏差。DRS则通过其独特的直接测序特性，规避了这些问题，能够提供更接近真实情况的全长、无偏倚的转录组图谱。
下表详细对比了DRS与其他转录组测序技术的一些关键差异：
（2）在检测RNA修饰方面的优势：革新表观转录组学研究
传统的RNA修饰检测方法，特别是基于免疫共沉淀的技术（如MeRIP-seq），在RNA修饰研究中发挥了重要作用，但也存在诸多局限。Nanopore DRS的出现，为RNA修饰的分析带来了革命性的变化。
下表详细对比了DRS与常见基于免疫共沉淀的RNA修饰检测技术在核心性能指标上的差异：
DRS在RNA修饰检测方面的优势是革命性的：
• “无抗体”和“无化学处理”：DRS直接利用纳米孔对RNA分子进行物理检测，无需特异性抗体或复杂的化学转化步骤，极大地简化了实验流程，降低了成本，并减少了引入偏差的可能性。
• 单分子分辨率和精确位点识别：DRS能够真正实现对RNA修饰的单分子分析，从而揭示修饰在单个转录本上的异质性及其精确位置。这为理解修饰的亚化学计量学特性和功能多样性提供了前所未有的深度。
• 整合全长转录组信息：DRS能够同时提供RNA修饰信息和其所在的全长转录本的序列、剪接、表达量等信息，使得研究人员能够直接探索RNA修饰对转录本命运（如剪接、稳定性、翻译）的影响，从而构建更完整的基因表达调控网络。
Nanopore DRS凭借其直接测序、长读长和单分子修饰检测的独特能力，在转录组学研究中展现出无与伦比的优势。它不仅在转录组学的基本分析（如转录本识别和定量）上具备了超越传统方法的优势，更在RNA修饰这一前沿领域提供了独一无二的直测能力。这种综合性的优势使得DRS成为当前和未来转录组学和表观转录组学研究中不可或缺的强大工具。
六、结语
Nanopore direct RNA sequencing (DRS)技术的问世，标志着RNA研究进入了一个“直读时代”。它突破了传统测序方法对逆转录和PCR扩增的依赖，实现了对天然RNA分子进行直接、全长测序的革命性飞跃。这一核心技术原理的突破，赋予了DRS在转录组学研究中无与伦比的独特优势和广泛的应用潜力。
DRS的应用场景涵盖了从基因组注释的完善到复杂基因调控网络的解析。无论是对全长转录本和可变剪接异构体的精准识别，Poly(A)尾长度的动态测量，非编码RNA（如lncRNA和circRNA）的全面捕获与解析，还是新型转录单元的发现与基因组注释的更新，DRS都展现出其卓越的能力，能够提供传统短读长或基于cDNA的长读长测序难以企及的深度和准确性。更重要的是，DRS能够在一个测序流程中同步观察转录本的结构、表达量与多种RNA修饰的动态变化，为我们理解生物体在不同生理或病理状态下的复杂分子响应提供了前所未有的全景视图。
尤其在RNA修饰分析领域，DRS的出现更是具有里程碑意义。它摆脱了对修饰特异性抗体或繁琐化学处理的依赖，实现了在单分子水平上对N6-甲基腺苷 (m6A)、5-甲基胞嘧啶 (m5C) 和假尿苷 (ψ)等重要RNA修饰的直接、高分辨率检测。这种能力使得研究人员能够以前所未有的细节探索这些表观转录组修饰的精确位置、丰度以及它们对RNA功能和命运的影响，从而揭示更深层次的基因表达调控机制。
综上所述，Nanopore DRS凭借其直接性、全长读取、减少偏差以及整合多维度信息的独特优势，正成为推动当前和未来转录组学和表观转录组学研究不可或缺的强大工具。它不仅提高了我们对转录组复杂性的认知，也为疾病诊断、预后判断、靶向治疗以及基础生命科学研究开辟了全新的道路。随着测序通量和准确性的不断提升，以及生物信息学分析工具的日益完善，DRS必将持续引领RNA研究迈向更精准、更全面的新纪元，为生命科学的探索带来更多突破性的发现。
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