日常掰虾
前面学习了DNA甲基化的基础知识，也了解了它的重要性，不知道的同学看这里，DNA甲基化知识概述。既然这么重要，我们当然要知道怎么处理数据了。不能只会理论不懂实践啊，像我这样只能靠脑袋以下为生的人肯定要会操作了。
毕竟！
不是有一句话说的很有道理么！
纸上得来终觉浅，觉知此事要躬行！
只能找这样的话来安慰自己让自己心安理得的干活了。废话说完，继续来说DNA甲基化。前面说过目前分析DNA甲基化的是以亚硫酸盐转化的测序技术（BS-seq），如全基因DNA甲基化测序
（Whole Genome Bisulfite Sequencing）和DNA甲基化靶向测序
（Reduced-representation bisulfite sequencing），这两者从技术上来讲没有本质的区别，只不过后者多了一步富集的步骤，即靶向富集一些甲基化区域，达到控制成本和分析质量的目的。现在分析BS-seq可供选择的软件不少，主流的有两款Bismark和BSMAP。虽然这两个软件都是用来分析BS-seq的软件，但工作原理却大相径庭。
测序 DNA BS 转化后经过 PCR 扩增发生了 C->T 转化，那么反向互补链则是 G->A 转化。普通DNA文库经过PCR扩增会生成正负2种链，并且这两条链是反向互补的，而经过亚硫酸盐处理后，DNA链由于C->T的转换导致两条链并不互补，所以经过PCR扩增后会形成正负4种链，即所谓的OT、CTOB、OB、CTOB。
Bismark 是一款比较有名的甲基化测序比对软件，Bismark 比对前会将所有 reads 进行 C->T 和 G->A 转换，并且将参考基因组同样进行这 2 种转换。非链特异性建库reads的方向无法确定，则转换后的2种reads要分别与参考基因组的2种情况分别进行比对，相当于每条 reads 进行 4 次不同比对，从里面选择最佳比对作为结果。如果是链特异性建库由于已知reads的属于哪一条链，则会只比对两种情况，这样比对速度上要很多。由于Bismark会将reads和参考基因组做C->T或G->A转换，就某一种情况来说转换后只剩下3种碱基，故Bismark的工作原理又被俗称为“三碱基比对”。
BSMAP是另外一款比较有名的甲基化测序比对软件，采用“wild-card”策略进行比对，简单来说就是用参考基因组创建“Seed Table”，每一个seed中的每一个C都有可能是甲基化的C或非甲基化的C，故在“Seed Table”中包含C->T转换的全组合，然将reads与“Seed Table”比对，选择最优的一种比对情况。
Bismark和BSMAP都是使用率比较高的软件，前面比对速度稍慢，但功能比较全面可以直接得到甲基化表格，而后者只是一个比对软件，速度上会快些，但需要结合甲基化提取软件来使用。选择哪一款结果都是可以被别人认可，具体选择哪一款自行决定吧！
搬砖姿势
上面说了那么多理论，下面就是如何搬砖了，看看具体如何使用软件来处理这样的数据。
Bismark
1、安装
wget https://github.com/FelixKrueger/Bismark/archive/0.22.3.tar.gz
tar -xzf 0.22.3.tar.gz
#为使用方便将Bismark路径添加到环境变量
export PATH=$PWD/Bismark-.22.3:$PATH
2、在参考基因组存放目录，运行如下命令：
bismark_genome_preparation genome.fasta
3、使用
bismark -p thread --rg_id prefix --rg_sample prefix --basename prefix -o align --genome_folder genomedir read
sambamba sort --natural-sort -m 8GB --tmpdir temp_dir -t thread -o align/prefix_nsort.bam align/prefix*.bam
bismark_methylation_extractor -p --comprehensive --bedGraph --gzip --genome_folder genomedir --multicore thread -o call align/prefix_nsort.bam
去重复视情况而定，WGBS 需要进行去重，RRBS 不需要去重。
deduplicate_bismark --paired --outfile prefix --output_dir dedup prefix*.bam
BSMAP
#安装
wget https://github.com/genome-vendor/bsmap/archive/refs/tags/v2.42.tar.gz
tar -zxf v2.42.tar.gz
cd bamsp-2.4
make
make install
#比对
bsmap \
-a fastq_R1 \
-b fastq_R2
-d path/hg19.fa \
-p 5 \
-v 0.05 \
2>report/BSMAP_report.txt | \
samtools view -b \
-o align/align.bam
#排序
sambamba sort \
-m 8GB \
--tmpdir tmp \
-t 5 \
-o prefix_sorted.bam align.bam
#去重
sambamba markdup \
--overflow-list-size 1000000 \
--tmpdir tmp \
-t 5 \
prefix_sorted.bam \
dedup.bam \
2> markdup_report.txt
#提取甲基化
MethylDackel extract \
path/genome.fa \
dedup.bam \
--opref prefix
参数有点多，这里不解释了，可以使用软件的help查看解释。PS：MethylDackel是一款提取甲基化的软件，需要自行安装才能使用。
搬完收工
上面介绍了两款比较出名的DNA甲基化处理工具，大家可以自己选择用一个，不必纠结选择哪一个，能解决问题就可以了。今天就分享到这里了~~~
