前言

哈哈哈~这是在2020年12月左右时，为了完成课程作业而写的论文，当时看了国外的一些综述，再加上一点点（真的是一点点，惭愧ing）的理解，然后拼拼凑凑写的论文，自认为写得还算认真吧，毕竟自己的水平也就只有这样了。然后想分享的原因是：课程结束了，但不想辜负自己写的东西了~~~当然了，由于本人水平有限，文章还是存在许多错误和不足的，望理解并指正了~~~

在类器官未兴起之前，实验研究模型主要是细胞系模型和动物模型。经典细胞系相对便宜，易于操作并且适用于多种实验技术；然而，细胞系存在严重的交叉污染，且能成功建立并稳定培养的细胞系通常是在体外有致癌潜能或已能致癌，遗传和表型在建立过程和实验研究的不停传代中已发生了适应性改变，与正常细胞和原先疾病细胞模型相去甚远，因此细胞系在个性化医疗和研究疾病发生发展等方面存在较大局限性[1]。而动物疾病模型，如异种移植瘤模型、基因编辑小鼠模型、化学诱导动物疾病模型等，虽然能更好地模拟人体内疾病特征和发生发展过程，但大多数是由因溯果型的实验研究，该建立过程成本高、耗时长且成功率不高[2]。

而随着科学技术不断革新，类器官技术开始兴起。类器官（Organoid）是源自于原代组织或干细胞等在体外特殊培养条件下形成的能够自我更新、自我组织并显示器官功能的3D模型，其具有稳定的表型和遗传学特征，能够在体外长期培养[3]。与传统实验研究模型相比，其包含多种细胞类型，突破了细胞间单纯的物理接触联系，形成了更加紧密的细胞间生物通信，细胞间相互影响、诱导、反馈，协作发育并形成具有功能的迷你器官或组织，能更好地用于模拟器官组织的发生过程及生理病理状态，因而在基础研究以及临床诊疗方面具有广阔的应用前景。《科学》杂志把类器官技术评为2013年“科技发展十大突破”，《Nature Methods》在2017年将其确定为年度技术，《新英格兰医学》杂志将该技术评为2019年“人类疾病临床前模型”。因此，类器官技术拥有巨大发展潜力，该领域在现在且持续到未来，引发全球的研究热潮并给生物研究领域带来许多可观的研究成果。

因此，本文以类器官为主题，先介绍类器官建立重要的三要素，包括关键的细胞原料、促进形成并维持生长所需的环境条件、固定并支持生长的支撑环境；然后介绍类器官的应用研究进展，主要涵盖疾病模型研究、药物研发及再生医学这三方面。

一、类器官的建立

成功建立的类器官一般具备四个特点：具备器官的三维结构；存在多种细胞类型，一般由干细胞本身分化产生；能表现出该器官的某些功能；有自我组织能力，组织形式与原本器官类似[4]。而一个类器官的成功建立，除了最关键的细胞原料外，还需要在特定的培养条件，主要包括促进并维持类器官的生长因子以及固定并支持其生长的支撑结构。

1 细胞原料

干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的细胞，具有再生各种组织和人体器官的潜在功能。利用干细胞在特定微环境中可定向分化的特点，可建立不同类型的类器官[5]。这已经在实验实践层面上得以证实，目前最常用多能干细胞和成体干细胞来建立类器官。

多能干细胞主要分为两种：胚胎干细胞，主要来源于植入前胚胎的内部细胞，该细胞已有完善技术支持它在体外稳定生长和增殖；诱导多能干细胞，是通过细胞重编程方法诱导转化形成的细胞，无道德伦理争议，而且来源广泛[6]。它们均具有无限增殖和多向分化能力，具备发育成胚胎三胚层的潜力，模拟不同生长微环境外加生长因子刺激，可诱导其生成内胚层、中胚层和外胚层来模拟胚胎发育，诱导对应不同的类器官生成。目前由多能干细胞产生的类器官如：来自内胚层的类器官包括肠道、肝脏、胃、肺和甲状腺等，来自外胚层的类器官包括脑、内耳和视网膜等。成体干细胞在成年人体内普遍存在，常位于特定的微环境中，在正常情况下大多处于休眠状态，在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力，因此其也可建立类器官[7]。现在大部分研究是用上皮来源性的成体干细胞来建立类器官，如肠道、胃、肝胆道类、胰腺、唾液腺和舌头等类器官[7-9]。成体干细胞类器官是研究组织再生和平衡的良好模型，而多能干细胞类器官更适合研究器官发育，有可能含有三个胚层的细胞，也可以包含非上皮细胞[10]。所以多能干细胞产生的类器官应用更广泛，但也有研究发现该来源的类器官随着培养时间增加，增殖速率减慢。

现在也盛行患者病变区域来源的类器官的相关研究，如肿瘤组织来源的类器官[11]，这从侧面反映肿瘤具备一定的干性。有研究将取得的肿瘤组织直接培养形成类器官，其可以很好地保持肿瘤的特性，或将其经重编程为多能干细胞，再经体外3D培养形成类器官，但后者培养肿瘤类器官的效率取决于癌组织类型或者某种特定的致瘤突变,而且形成的类器官可能只是肿瘤的亚克隆,失去肿瘤遗传异质性。此外，利用多种类型细胞混合培养后，通过自我聚集和器官化也可最终形成器官结构，但该方法建立的类器官缺乏稳定性和增殖潜能。

类器官目前仅限于模拟体内器官的结构，在功能表征上存在许多不足，从干细胞发育形成特异的类器官，依赖细胞分化潜能和增殖潜能，需要特定培养条件，提供更精确有序的分化控制条件，涉及很多细胞内精细的分子调控过程。

2培养条件

不同类型类器官的培养条件有较大的差异，根据实验目的不同需适当调整生长因子的类型或比例，如促增殖型培养基和促分化型培养基就存在巨大差异。但笔者觉得类器官的培养条件可简单地归为两种要求：需要促进细胞生长的因子，如EGF等，以及维持细胞干性的生长因子，如R-spondin、Wnt3a等。现在大多类器官的培养配方是根据两种要求并通过小分子药物文库筛选后进行改进。以下举个例子，主要介绍Han Clevers团队如何从小鼠肠道类器官建立开始（膜拜ing~~~），并以此为基础不断改进配方，逐渐应用于肝脏类器官以及其它类器官的培养。

在2009年他们从小鼠肠段分离出单个Lgr5+肠干细胞，成功建立了小鼠肠类器官[12]。在这篇文章他们通过将具有干性的肠隐窝细胞培养在含有ENR（EGF、Noggin、R-spondin）的三维基质胶培养体系中，以此成功建立肠类器官，其中R-spondin是细胞活化Wnt-β-catenin信号通路并维持细胞干性必不可少的因子；EGF是促进增殖的因子；Noggin亦可促进干细胞分裂并增加细胞数目。后续发现添加Rho激酶抑制因子可以抑制胚胎干细胞的失巢凋亡，而加入Notch的激动剂，可以维持干细胞的增殖，大大提高成功率。在2011年他们改进条件来培养人来源的类器官，通过加入Wnt3a促进于类器官的形成和长大，加入胃泌素和烟酰胺提高了培养效率[13]。但在此培养条件下，人结肠类器官在扩增1个月后，由芽殖结构转变为囊性结构，增殖逐渐减少，最终在3个月内停止生长。随后他们通过各种小分子调节剂筛选，最后发现2个小分子抑制剂，A83-01和SB202190不仅能提高接种成功率且能延长了培养时间，且人结肠类器官又恢复了出芽殖结构，而添加FGF10亦增加类器官的生存时间。在2014年，他们成功培养了人肝脏型类器官[14]，发现加入FSK，一种cAMP信号通路的激动剂，可诱导胆道细胞的增殖，提高类器官传代效率；并阐明了Wnt信号通路的活化、cAMP通路的活化和TGF-β通路的抑制对肝类器官的干性维持和长期生长发挥重要作用。在2016年，Han Clevers联合其它科学家发表了一篇如何建立并培养小鼠或人类来源的肝脏类器官和胰腺类器官的方法，在这篇文章中详细介绍了培养的每个步骤及注意事项[9, 15]。而在2019年，他们团队在肝脏类器官已成功建立的基础上研究肝癌的发生发展机制，阐明了BAP1在促进肝癌形成中发挥关键作用[16]。

由此可见，科学研究过程不是一蹴而就，需要每一步踏踏实实的探索。在类器官培养条件摸索中，固然工程量巨大且耗时长，但其在未来带来的效益以及对科学和临床研究的促进作用是不可估量的。

3支撑结构

在人体中，体内细胞与周围的微环境处于不断相互作用的状态中,细胞持续重塑细胞外基质进而实现自身的扩散、增殖和分化。因此，为了构建的类器官更能模拟体内组织真实的生理、病理学结构，模拟天然细胞外基质而建立的支撑结构就显得十分重要。类器官的支撑结构目前应用最多的是基质胶、合成生物支架和天然支架等。

第一，基质胶是从EHS小鼠肉瘤中提取的一种基底膜基质，其包含某些细胞外基质蛋白，但其成分复杂、不明确、多变，其与细胞互作机制仍不明晰[17, 18]。不同批次的基质胶的机械和生化特性的不一致，导致实验存在不确定性并缺乏可重复性。但基质胶是最早也是目前应用最广泛的类器官实验研究的支撑结构[19]。第二，合成支架，如水凝胶等，具有化学定义清晰的结构，其生物、机械和物理参数可人为调节，在空间和动态上控制微环境结构和基质材料上具有一定优势[20]。同时，可用传统合成方法轻松生产或应用3D打印技术合成，批次变化极小，进而很好的帮助类器官构建。如有研究开发了一种可渗透气体、营养物质和大分子的支架，可以诱导肠干细胞形成迷你肠管，且该研究技术可通过调整水凝胶支架的特定特性，应用于其他器官样干细胞[21]。第三，天然生物支架可以保持器官生长的固有自然微环境，可以更好地模拟生物环境与细胞的互作，但来源少且构建技术不成熟。目前已有肠衰竭患者来源肠道的肠道类器官及天然支架结合的移植体出现，且将该移植体在体外和小鼠实验已证实具备与天然肠道相似的结构和功能特点[22]。

实际上，支撑结构也不是个必备条件，可通过其它方式阻止细胞贴壁并维持细胞自我组织能力亦可成功建立类器官，如使用低吸附板、磁悬浮技术、旋转生物反应器等。2017年，Morizane用96孔低吸附板将人类多能干细胞成功分化成肾素祖细胞，继而形成肾脏器官并证实该方法具有高的可重复性[23]。2010年，基于磁悬浮技术和纳米颗粒组装培养3D类器官的系统被开发，并在后续有研究将其应用于细支气管、唾液腺等的建立[24-26]。而旋转生物反应器主要应用于大脑类器官的建立，该过程也需要基质支持[27, 28]。

二、类器官的应用

类器官在构建疾病模型、研发临床药物和拓宽再生医学的应用前景是非常可观。因为类器官在某种程度上能更好地类比人体内真实的器官特征，有利于模拟该器官相关疾病的发生发展，对于研究器官或疾病中细胞之间通讯、特征结构形成、侵袭运动、免疫甚至表观遗传学变化等方面均具有一定的优势。

1 疾病模型

类器官技术已经较为成熟且成功应用在多种疾病研究模型中。一方面它比细胞系更好模拟体内的真实环境，维持细胞的遗传和表型特征，有利于研究疾病是如何发生发展；另一方面，它构建时间较短、培养成本比动物培养低、成功率也相对较高，有利于缩短实验周期并尽快进行临床转化验证。

类器官作为一种疾病模型，具有无可比拟的便利和优点。由病原体感染或其它化学因素而诱发的疾病的感染发生过程及病变过程一直是难以在体外进行研究，但是类器官与病原体等共培养能帮助我们在体外更高效地研究这类感染类疾病的发生和发展。如在2020年，新型冠状病毒突然地席卷全球，给世界正常发展和人民健康生活造成巨大伤害。在这过程中，使用细胞系或动物模型已不能很好并及时地模拟SARS-CoV-2在人体内的真实感染过程，但是利用人体组织来源培养出的类器官模型，在短时间能模拟人体器官的微型组织细胞结构和体内微生态，较好地在体外重现SARS-CoV-2在人体内入侵多种组织器官过程[29]。有大量研究报道了新冠病毒感染肺部细胞的病理过程、对其它器官的感染和伤害机理、影响人体免疫系统功能等[30-32]。

类器官结合基因编辑技术有助于研究基因突变诱导类或促进类的疾病，帮助发现疾病的相关生物标志物。如通过不断突变肿瘤遗传特征谱上的特征基因，发现何类基因在癌症发生和恶性发展中发挥关键作用，有利于靶向治疗研究及疾病预测等[16]。类器官也有助于研究哪类细胞更容易发生病变。如在以前人们通常认为胰腺腺泡细胞是胰腺导管细胞癌发生过程中起主导作用的细胞，但通过类器官技术证明了胰腺导管细胞的转化也能够诱导胰腺导管细胞癌的形成[33, 34]。而现在建立了许多类器官库，这些来源于不同个体的模型有利于我们探讨个体间疾病发生和发展的共性和异质性，让我们更方便且更好地了解人体真实复杂的生理特征[35]。

2 药物研发

类器官技术的出现为许多疾病，特别是肿瘤的药物筛选及药物毒理性研究提供了良好的实验平台。利用患者来源的原发性肿瘤组织进行类器官培养，可以很好重现肿瘤来源的组织结构及不同区域细胞的体外特征。有研究通过基因组测序和全外显子测序对比了结肠肿瘤类器官模型和对应来源的原始肿瘤组织，证实了在发育的结肠肿瘤类器官模型和活组织检查之间有90%的体细胞突变和DNA拷贝数分布得以保存[36]。也有研究通过组织学、免疫组织化学和基因组学方法，证实了不同肝癌类型中建立的肿瘤类器官模型保持了器官位点特异性的组织学和遗传特征[37]。更有研究人员用微阵列芯片对ATCC提供的25种人类癌症类器官进行DNA甲基化状态做图景分析，结果发现所研究的类器官能更好地保留原发组织的表观遗传背景，更接近相应原发肿瘤的DNA甲基化分布[38]。因此类器官培养保留了原始疾病特征，这就使得对药物反应更接近人体真实情况，可预测药物敏感性和不良反应等。

类器官能够无限扩增，可以对无限数量的药物及组合进行测试，研发癌症治疗的新方案，给患者提供参考治疗方案，延长患者生命，实现个体化精准治疗的目标[39]。有研究将来源于结直肠癌或胃食管癌患者的110例肿瘤组织样本进行类器官培养，然后对55种药物进行敏感性检测，用于指导临床用药[40]；后续研究结果表明，与患者临床结果进行对比，类器官药物敏感试验敏感性达到100%，特异性93%，预测阳性的有效值有88%、阴性预测值达到100%，证明了类器官可以帮助临床医生们为肿瘤患者选择合适的治疗方案。此外，类器官研究已拓展至免疫治疗研究领域，并研究如何构建血管化类器官[41, 42]，这对未来研究药物如何在血管运输分泌及降解，如何调动免疫功能等方面将有巨大的推动力。

3 再生医学

类器官技术在再生医学上具有显著优势和实现可能性，因为它来源多样且若取材于同一个体，在生理结构和功能更接近原器官，避免免疫排斥反应和伦理等问题。有研究通过构建肠道类器官及天然生物支架，设计策略来构建组织工程化肠道，使得人工肠道有适当的结构和功能来治疗短肠综合症[22]。也有研究将肝外胆管细胞类器官种植在不同形状的生物支架上来获得类似胆囊壁及肝外胆管的生物工程组织，并成功重建了胆囊受损小鼠的胆囊壁以及修复了小鼠的肝外胆管损伤[43]。此外，有研究用人体多能干细胞培养出皮肤类器官，该器官具有分层的表皮、富含脂肪的真皮、含皮脂附属器和完整神经回路，并将其移植到裸鼠身上能生长出毛发[44]；还有研究基于人骨膜源细胞形成类器官，进一步组装来修复大段骨缺损[45]。因此，类器官在再生医学具有巨大的应用潜力和广泛的应用范围。

类器官并不是真正器官，功能实现和结构特征等方面存在许多不足，但相信随着技术发展，这都会逐渐被攻克。如多器官整合是干细胞技术的一项巨大挑战，但在2019年有研究团队成功利用培育出了3种互相连接的类器官，包括肝脏、胰腺和胆管[46]；在2020年有研究获得了大脑皮层、后脑脊髓的类器官，并与骨髓肌球体组装在一起以生成皮质运动类组装体[47]。因此，随着类器官技术不断发展与成熟，未来的类器官将与真正器官在生理和结构上能达到抑制，最后实现器官再生。

严格来讲，类器官并不是一个全新的工具，而是在细胞或组织结构三维培养技术基础上的革新，但是随着人们对生物机理研究的深入和干细胞体外研究技术的日益成熟和丰富，科研人员才成功地利用干细胞特性，模拟器官体内生长的营养环境和物理环境，构建出人类组织体外类器官模型。目前，类器官已经在多个方面展现出巨大的应用潜力。它能用于构建各种类型的疾病模型，模拟疾病的发生发展，为其生物学机制研究提供新渠道；实现大规模药物筛选，寻找精准有效的治疗药物并指导临床用药；拓宽再生医学研究领域，在未来或许能在器官移植彰显独特优势。

类器官在科学研究和临床应用中展现了光明前景，但其目前仍然面临许多局限性和挑战。作为模型，类器官在细胞类型表现、器官结构和成熟功能等方面与体内器官存在一定的差异，如类器官缺乏完整血管和多样的免疫细胞、缺乏与其它器官的互作研究等，这限制了相关病理和生理机制研究。同时，由于培养条件尚未成熟，如营养和氧气供应不足等，难以形成大的类器官组织，难以在体外长期稳定地存活，而且利用多能干细胞构建类器官存在更大的可变性。此外，由于不同的样本来源、不同培养方法来建立类器官模型，导致实验结果在不同实验室之间难以重复、妨碍数据的进一步验证和引用。

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