培养的人肝细胞类器官具有代谢功能

文章来源：“2025-Nature-Generation of human adult hepatocyte organoids with metabolic functions”.

研究背景

肝脏是代谢功能的核心器官，肝细胞负责糖异生、脂肪酸合成、胆汁酸合成等关键功能。现代生活方式导致代谢相关脂肪肝疾病（如非酒精性脂肪肝）成为全球健康挑战。然而，现有肝细胞模型难以长期维持成人肝细胞的代谢功能，且在体外培养中易发生“管腺化”退化，阻碍了疾病研究和药物开发的进展。

图1：人类成年肝细胞类器官（HHO）的体外培养与代谢功能验证

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1. 模型构建：
   • 培养基设计：使用含Wnt通路激活剂（如R-spondin1）、STAT3激活剂（IL-6）的扩展培养基（EM），抑制肝细胞分化信号（如TGF-β），维持HHO的增殖能力。
   • 形态观察：类器官呈三维囊状结构，直径随时间扩展至200-500 μm，培养周期超过6个月仍保持稳定。
2. 功能验证：
   • 免疫荧光染色：
     • 肝细胞核因子HNF4α（标志成熟肝细胞）和药物代谢酶CYP3A4高表达，证实代谢功能保留。
     • 糖原储存：PAS染色显示类器官内糖原颗粒分布与体内肝细胞一致。
     • 脂滴生成：油红O染色显示HHO可主动合成脂滴，模拟脂肪肝病理特征。
   • 对比传统模型：传统2D培养肝细胞在7天内丢失CYP3A4表达，而HHO在长期培养中维持功能。

图2：HHO在小鼠肝脏中的再生能力与结构重建

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1. 移植实验：
   • 操作流程：将荧光标记的HHO移植至免疫缺陷小鼠（如NSG小鼠）肝脏损伤模型（如四氯化碳诱导），术后4-8周观察整合情况。
   • 再生效率：移植后HHO存活率>80%，显著高于原代肝细胞移植（<30%）。
2. 结构重建：
   • 代谢分区：
     • 门静脉区：再生肝细胞高表达尿素循环酶CPS1，模拟氨代谢功能。
     • 中央静脉区：再生细胞表达缺氧标志物HIF1α和药物解毒酶CYP2E1，再现体内代谢梯度。
   • 功能整合：再生区域血管化（CD31+内皮细胞）和胆管结构（CK19+胆管上皮细胞）形成，证明HHO与宿主组织功能耦合。

图3：HHO成熟诱导与药物毒性模型构建

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1. 成熟诱导策略：
   • 培养基优化：
     • 去除EGF以抑制过度增殖，加入地塞米松（促进糖异生）和甲状腺激素T3（增强脂肪酸氧化）。
     • 添加FGF19和Notch抑制剂（DAPT），模拟体内肝细胞成熟信号。
   • 功能提升：成熟后HHO的CYP3A4酶活性达到原代肝细胞的90%，尿素分泌量增加3倍。
2. 药物毒性测试：
   • 对乙酰氨基酚（APAP）模型：
     • 暴露于10 mM APAP 24小时后，HHO出现ATP水平下降（降低60%）及LDH释放（增加4倍），模拟药物性肝损伤。
     • 病理特征：细胞凋亡（Caspase3激活）和线粒体肿胀（电镜观察），与临床毒性反应一致。

图4：HHO在代谢相关脂肪肝疾病建模中的应用

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1. 体外脂肪肝模型构建：

   • 诱导策略：
     • 在高糖高脂培养基（含棕榈酸/油酸，比例1:2，浓度500 μM）中培养HHO 7天，模拟饮食诱导的代谢紊乱。
     • 添加胰岛素（100 nM）和地塞米松（1 μM），增强脂质合成信号。
   • 病理表型：
     • 脂质堆积：油红O染色显示脂滴面积占比从基础培养基的5%升至35%，与患者肝脏活检数据（平均30%-40%）高度吻合。
     • 氧化应激：活性氧（ROS）水平增加2.8倍，线粒体膜电位下降50%（JC-1染色量化）。

2. 分子机制解析：

   • 关键通路分析：
     • 免疫印迹显示SREBP1c（脂质合成调控因子）表达上调2倍，PPARα（脂肪酸氧化调控因子）下调60%。
     • 炎症标志物TNF-α和IL-6分泌量分别增加4倍和3倍（ELISA检测）。
   • 功能损伤验证：
     • 胰岛素抵抗：HHO对葡萄糖摄取的响应降低40%（2-NBDG荧光探针定量）。
     • 胆汁酸代谢异常：胆汁酸转运蛋白NTCP表达下降70%，导致细胞内胆汁酸蓄积（LC-MS检测增加2.5倍）。

3. 药物干预测试：

   • 治疗验证：
     • 使用PPARα激动剂（非诺贝特，50 μM）处理3天后，脂滴面积减少55%，ROS水平恢复至基线。
     • FXR激动剂（奥贝胆酸，10 μM）可逆转胆汁酸转运障碍，NTCP表达恢复至正常水平的80%。

图5：基于CRISPR的代谢性肝病模型构建

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1. 基因编辑实验：
   • 靶点选择：敲除PNPLA3（rs738409突变基因，与非酒精性脂肪肝相关），使用sgRNA与Cas9蛋白共转染HHO。
   • 编辑效率：通过T7E1酶切和测序验证，敲除效率达70%-85%。
2. 疾病表型分析：
   • 脂质堆积：编辑后HHO的甘油三酯含量增加2.5倍，脂滴面积占比从5%升至25%，模拟患者肝脏病理。
   • 机制解析：RNA测序显示PNPLA3缺失导致脂质合成基因（如SREBP1c）上调，氧化基因（PPARα）下调，揭示疾病分子机制。
   • 药筛应用：利用该模型测试FXR激动剂（如奥贝胆酸），显示脂质含量降低40%，验证模型的药物响应性。

研究结论

1. 技术突破：通过激活Wnt和STAT3信号通路，解决了肝细胞体外扩展与功能维持的矛盾，建立了首个稳定、可长期扩增的成人肝细胞类器官培养系统。
2. 功能优势：HHO在体外和体内均表现出与天然肝细胞相似的代谢、药物代谢及再生能力，且功能在长期培养后仍能维持。
3. 应用潜力：
   • 为代谢性肝病（如脂肪肝）的机制研究提供高保真模型。
   • 支持药物毒性测试、个性化医疗及基因治疗（如CRISPR编辑）的开发。
   • 再生医学中可用于肝损伤修复或移植替代方案。

意义：该研究填补了成人肝细胞体外功能模型的空白，为肝脏疾病研究、药物开发和临床治疗提供了革新性工具。