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前言

最近接触比较多肝纤维化项目，包括空转、单细胞和普通的BULK转录组，本文是肝脏疾病类器官构建，所以结果是比较确定的，只是对比不同处理和培养哪种效果更好，适合了解纤维化进展和哪些分子和细胞参与，以及其机制；此外本文数据使用Python分析数据的图很好看，之后可以复现一下。

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摘要

代谢功能障碍相关脂肪变性肝病（MASLD）发病率不断上升，而且有效治疗方式很少。因此，测试新疗法的体外系统是必不可少的。虽然最近出现了人类肝脏类器官模型来评估脂肪变性肝病，但对其转化潜力的系统评估仍然缺失。在这里，我们评估了MASLD的人类肝脏类器官模型，比较测试了三种条件下的疾病诱导：油酸（OA）、棕榈酸（PA）和TGF-β1。通过单细胞分析，我们发现所有三种模型都能诱导炎症信号，但只有TGF-β1能促进胶原生成、纤维化和肝星状细胞扩张。与此形成鲜明对比的是，油酸可以改善纤维化特征，减少肝星状细胞数量。将每个模型的数据与MASLD疾病进展相关的基因表达特征联系起来，进一步证明棕榈酸和TGF-β1更有力地模拟炎症和纤维化。我们的研究结果说明了通过临床疾病进展特征对MASLD类器官模型进行分层的重要性，为未来的类器官损伤模型提供了单细胞参考，并使我们能够在动态、多谱系的人类体外系统中研究不断演变的脂肪性肝炎、纤维化和HSC对损伤的易感性。

肝病进展过程

从脂肪肝（steatosis）→ 肝脏炎症（MASH）→ 肝纤维化（fibrosis） → 肝硬化（cirrhosis） 是一个逐渐发展的过程。为了区分肝纤维化的严重程度，医生们把肝纤维化分为F0、F1、F2、F3和F4，5个等级：F0为无肝纤维化，≥F1为轻度肝纤维化，≥F2为中度肝纤维化，≥F3为重度肝纤维化，F4为肝硬化。

肝硬化是肝纤维化发展到最严重的结果；

肝纤维化是可逆的过程；

只有30%的steatosis会进展到MASH

非酒精性脂肪肝模型

代谢功能障碍相关脂肪变性肝病（MASLD）又叫非酒精性脂肪肝，与肝脏脂肪代谢异常有关。

脂肪酸可以激活肝细胞炎症通路，使其分泌细胞因子比如肿瘤酸死因子（TNF）从而激活Kuffer细胞，Kuffer细胞和招募的其他免疫细胞释放TGF-β，TGF-β可以激活HSC细胞（肝星状细胞）转分化为肌成纤维细胞。

肌成纤维细胞释放细胞外基质（主要是collagen type I 和 III）形成纤维瘢痕。

MASLD的关键是肝脏中脂肪酸的长期暴漏，因此可以人多能干细胞产生肝脏类器官，再给予OA、PA、TGF-β1刺激构建疾病模型。有两种细胞培养方式ULA（超薄附着物板）和OS（摇床）

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结果1：类器官模型包括了肝脏中多种细胞类型

首先验证模型有效性，图A使整体实验设计图，从hPSCs人多潜能干细胞分化成HLOs肝脏类器官，四种不同培养环境产生肝类器模型，选出最优培养方式OS，再用不同刺激构建疾病模型，再评估炎症和纤维化程度，脂肪肝模型有效性评分。图B用RT-pRCR说明多潜能基因表达下降，肝脏基因表达上升，图C从组织学水平说明模型有效性。

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接下来是单细胞测序数据，作者使用了3种注释方法，注释到了4种肝脏中的主要细胞hepatocyte（肝细胞）、HSC（肝星状细胞）、 cholangiocyte（胆管上皮细胞）、ESC（胚胎干细胞）；图E为细胞marker基因表达情况；图F是对应的细胞类型的差异基因富集到的通路

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结果2：不同培养方式影响肝细胞成熟、细胞类型分布

图A有两种细胞培养方式ULA（超薄附着物板）和OS（摇床）；

图B和之后的许多单细胞展示图都是用了ForceAtlas2图，可以展示空间过程（spatialization process），图B-C说明两种培养条件细胞类型分布和比例不同。

图D说明ULA培养方式HSC细胞marker基因表达更高；

图E 肝细胞差异基因除了富集到代谢通路，还富集到了strogen metabolism 、 coagulationrelated pathways等通路

图F：细分肝细胞亚群为hepatoblast-, fetal hepatocyte-, and adult hepatocyte-like cell等，FA图看下细胞类型分布

图G：查看marker基因表达情况，说明两种培养方式产生的肝细胞亚群种类有差异

图H：空间区域打分，根据PMID: 36109670文章中定义的6群细胞marker基因，给自己的数据打分（相当于注释了细胞类型为0-5类），并观察到肝细胞主要分布在 periportal, interzonal, and pericentral zones（Periportal-C5:0, Periportal-C14:1, Periportal-C6:2, Interzonal-C15:3, Pericentral-C1:4, Pericentral-C3:5，0-5不同数字表示不同区域）

综上，比较了不同培养方式影响肝细胞成熟、细胞类型分布，得出结论OS培养方式出来的细胞更成熟

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结果3：纤维化类器官模型

前边的都是正常模型，非疾病模型，这里使用TGF-β1刺激产生纤维化类器官模型

图A四种培养方式

图B两种培养方式3种刺激，TGF-β1刺激使细胞形态变化，表面变粗糙，OA作为对比再OS培养条件下也变黑了，这说明TGF-β1刺激可以模拟肝纤维化。

图C-D：TGF-β1刺激使细胞细胞变小

图E-F：天狼猩红染色看type I and III collagen纤维化细胞中沉积，只有OS和Matrigel培养方式有显著性差异，说明这两种培养方式可以模拟纤维化

图G：RT-qPCR结果说明只有TGF-β1+OS培养条件下collagen基因表达有差异

图H：BODIPY染色，看TGF-β1、OA、PA暴漏下脂肪积累都增加；

图I：BODIPY染色，画一个区域统计里边没有染色到的地方，只有OA条件下有差异；

图J：甘油三酯差异

图K：天狼猩红染色看type I and III collagen沉积，只有OA暴露可以减少collagen累积（蛋白水平）；

图L：与K一致的结论，collagen的基因COL1A1在OA暴露条件下表达下降（转录水平）；PA 暴露条件下TNFA表达上升（促进炎症）

综上：TGF-β1在OS培养条件下可以模拟纤维化，OA、PA刺激下有不同的表型与TGF-β1对比

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结果4：单细胞水平下3种刺激有不同的炎症反应和纤维化状态

图A：OS培养环境OA、PA、TGF-β1暴露下，单细胞测序，颜色为暴露条件

图B：FA图细胞类型注释，颜色为细胞类型，细胞比例变化；OA 暴露 可以减少 HSC-like cells 比例并增加 hepatocyte-like cells比例

图C：细胞marker基因表达

图D：OA、PA、TGF-β1、Control条件下细胞周期，通路评分情况

图E：OA、PA、TGF-β1条件下纤维化和炎症基因在各细胞类型中的表达差异

图F：差异基因富集（图比较好看，之后可以模仿画一下）

综上：不同处理下细胞比例差异；炎症基因，纤维化基因表达差异；富集通路差异

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结果5：OA处理下的细胞通讯与PA和TGF-β1不同

使用CellPhoneDB分析细胞通讯情况

图A：色块颜色表示该通讯占总的通讯数量的百分比。总体上三种处理后细胞通讯数量增加；OA处理主要增加hepatoblast 2-, cholangiocyte-, and DC-like cells (HB2, CHOLs, DCs)细胞间的通讯；PA处理主要增加cholangiocyte-like, hepatocyte progenitor-, fibroblast- and SMC-like cells (CHOLs, DCs, HB1, FIBs, SMCs)细胞间的通讯；TGF-β1处理主要增加SMC- (most likely representing myofibroblast-like cells) and HSCs-like cells，HSCs-SMC-like cell 、 HSCAH-like 细胞间的通讯

图B：细胞通讯数量比例图，OA处理减少SMC-like参与的通讯；TGF-β1处理增加SMC-like参与的通讯；

图C：处理相对于对照的通讯比例变化量（delta）聚类热图，说明TGF-β1诱导的通讯模式与OA和PA不同；整体上三种处理后与肝纤维化相关的细胞类型HSCs、SMCs通讯都有变化；

图D：详细分析疾病模型中细胞特异的通讯类型了；PA处理后出现TNF superfamily (TNFS) 通讯，说明了炎症反应；TGF-β1处理后出现 PDGFB 和 PDGFRB通讯，说明了肝纤维化；OA处理后出现CXL2 和 DPP4通讯，而DPP4与脂肪变性有关；

图E：三种处理、control之间显著的受配体交集；

图F：OA处理后新的通讯方式DPP4-CXCL12，说明HSC与肝细胞和成纤维细胞之间通过CXCL12通讯；

PA处理后出现HB-like cells (TNFS10) → SMC-like cells (TNFRSF11B)通讯，TNFS10编码TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand (TRAIL)自噬配体，TNFRSF11B编码TRAIL的受体 Osteoprotegerin (OPG) ；TGF-β1处理后出现matured hepatocyte cells (TNFRSF11B) → SMC-like cells (TNFS10)通讯；OPG表达说明在肝纤维化中TRAIL诱导的自噬需要肌成纤维细胞激活，与SMC-like cells间的通讯增强说明PA 和 TGF-β1处理后肌成纤维细胞逐渐纤维原激活；

PA 和 TGF-β1处理后的SMC-like cells (SPP1&CD44)（自分泌）通讯，SPP1编码Osteopontin可以结合CD44，进而调节细胞粘附和迁移

TGF-β1处理后的肝细胞（PDGFRA） → HSC通讯，肝细胞（PDGFRB） → HSC通讯，肝细胞（PDGFRB） → SMC通讯，DC管细胞（PDGFRB） → HSC通讯，DC管细胞（PDGFRB） → SMC通讯，PDGFB在肝纤维化中参与介导HSC激活；

综上：描述了3种处理后细胞通讯变化，并且发现了新的少研究的TGF-β1处理后的SMC（TGFB1/CD44）→ 肝细胞（Androgen receptor (AR)/FGFR2）通讯，并且作者认为AR可以作为潜在的靶点
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结果6：细胞轨迹分析

从脂肪变性到脂肪性肝炎，再到纤维化，可以理解为一个连续的过程，包括肌成纤维细胞谱系的出现。基于fa图，使用Palantir做轨迹分析

图A：A-C首先分析肝细胞分化，细胞类型fa图

图B：（上）箭头指向分化末端的细胞类型，分化起点是根据肝细胞前体的marker基因CEBPA和AFP表达情况，hepatoblast-like细胞发育成cAH：cycling adult hepatocyte-like state；cholangiocyte细胞发育成DC-like terminal states细胞；（下）分化潜能

图C：根据3个branch分化概率选择top100 细胞，然后查看3种分支细胞的分布和在不同处理中的比例；cAH主要分布在control组，DC主要分布在TGF-β1组；

图D–F ：对HSC亚群进行类似A-C的分析，选择IGFBP highest/DDIT4 pos为起始细胞，有5个分化末端HSC1-3、fibroblast-like cluster (FIB)、SMC；

HSC1 和 HSC3 主要分布在control 和 TGF-β1组，SMC主要分布在TGF-β1组

综上：只有TGF-β1处理，能够产生肌成纤维细胞

图G-J：使用MAGIC进行基因表达量填充（因为单细胞数据很多缺失值），然后查看炎症和纤维化基因随时间变化趋势（G、J）和分布（H）；
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结果7：预测MASLD严重程度的基因特征评分从PA到TGF-β1逐渐增加，并显示出OA的混合反应

从文献中获取16和98个基因的fibrosis signature

图A：整体上比较处理组与control组相比这些基因的表达差异

图B：这些基因的表达点图

图C：每类细胞中比较处理组与control组相比这些基因的表达差异

综上：OA组中signature表达下降说明是MASLD进展有混合状态，AH-, cholangiocyte-, and HSC-like细胞无纤维化特证；PA 和 TGF-β1处理后逐步获得MASLD signature基因的表达；成肝细胞（HB）基因变化最大，
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讨论

最好的培养方式是OS

3种处理适用于构建不同的模型

OA：模拟脂肪变性刚开始阶段

PA：脂肪性肝炎的炎症变化

TGF-β1：脂肪性肝炎和纤维化

缩写

MASLD：Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease 代谢功能障碍相关脂肪变性肝病

MASH：metabolic dysfunction-associated steatohepatitis 肝脏脂肪炎症，脂肪变性引起的炎症

NAFLD：non-alcoholic fatty liver disease 非酒精性脂肪肝

OA：oleic acid 油酸，单不饱和脂肪酸

PA：palmitic acid棕榈酸，饱和脂肪酸

HSC：hepatic stellate cells，肝星状细胞