一般KO（Knockout，基因敲除）小鼠的设计并没有一个“一刀切”的答案，具体从哪个外显子开始、敲掉多少个外显子，取决于目标基因的结构和想要达到的敲除效果。
普遍遵循的设计原则和策略如下：
核心设计目标
KO设计的最终目标是：彻底破坏目标基因的功能，使其无法产生有功能的蛋白质（通常是完全缺失或产生截短且无功能的肽段）。
1. 从哪个外显子开始？
通常不会从第一个外显子开始，而是选择第二个或第三个编码外显子（Coding Exon），目的为：
1）避免影响调控元件：第一个外显子通常包含5‘非翻译区（5’ UTR）和启动子区域附近的重要调控序列。直接删除第一个外显子可能会意外破坏这些调控元件，影响邻近基因的表达，导致表型分析复杂化。
2）确保移码：选择靠前的编码外显子进行敲除，可以最大化地导致其后的所有外显子读码框（Reading Frame）移位，从而在最上游就破坏整个基因的翻译。
3）通用性强：很多基因有多个转录本（剪接变体），选择第二个或第三个保守的外显子进行敲除，通常可以确保敲掉该基因的所有（或绝大多数）主要转录本，避免因选择性剪接而产生漏网之鱼（有功能的截短蛋白）。
例外情况：如果目标基因的特定功能域由某个后面的外显子编码，而实验目的正是研究该功能域，那么设计时会特异性删除那个包含功能域的外显子。
2. 敲掉多少个外显子？
通常至少敲除一个完整的外显子，但更常见的做法是敲除两个或以上的外显子。
为什么？
防止通读（Read-Through）和功能补偿：这是最关键的原因。
如果只敲除一个外显子，细胞有时会通过“外显子跳跃”（Exon Skipping）的方式，在mRNA剪接时跳过被敲除的外显子，从而产生一个缺失部分氨基酸但仍保留读码框的蛋白质。这个蛋白可能仍具有部分或全部功能（称为“渗漏”现象），导致敲除不彻底。
敲除多个连续的外显子（例如，删除Exon 3-5）可以极大程度地防止这种“外显子跳跃”的发生，因为跳跃这么大片段会完全破坏mRNA结构，或者即使发生跳跃，也必然导致移码，从而确保产生无功能的截短蛋白。
确保移码和提前终止：删除多个外显子可以确保编码序列长度发生巨大变化，并在删除片段之后立即引入提前终止密码子（Premature Stop Codon）。这样产生的mRNA会触发的无义介导的mRNA降解（Nonsense-Mediated mRNA Decay, NMD）机制被降解，即使不降解，翻译出的蛋白也是毫无功能的。
总结：通用设计策略
一个稳健的、适用于大多数蛋白编码基因的KO策略是：
1）选择目标区域：选择第二个或第三个编码外显子作为靶点。
2）确定删除范围：删除该外显子及其下游的一个或多个外显子（例如，删除Exon 2-4）。通常删除的DNA片段长度在1kb到几个kb之间。
3）验证设计：
确保删除后会引入移码。
确保在删除片段之后很快会出现提前终止密码子。
使用生物信息学工具检查是否会影响该基因的其他重要转录本或邻近基因。
总之，KO鼠的设计是一个精心策划的过程，从Exon 2-4开始，敲掉2-3个外显子是一个非常常见且有效的策略，可以最大限度地确保获得完全性基因敲除小鼠。最终方案必须根据具体基因进行个性化设计。在开始实验前，查阅国际KO小鼠计划（如IKMC）中已成功的项目设计是非常好的参考。
