RNA导向的原核CRISPR相关(Cas)蛋白能够在哺乳动物基因组中创建靶向双链断裂，这一发现推动了CRISPR技术的发展。借助自然的DNA修复机制，CRISPR系统能够更容易、更精确地修复缺陷基因，基因治疗提供了新的可能性。CRISPR已成功应用于临床前研究和多项临床试验中，用于消除有害的突变基因、纠正编码序列中的错误以拯救疾病表型。然而，大多数遗传性疾病是由基因组的编码和非编码区域的突变、缺失和重复组合而成，因此需要更复杂的基因组工程策略，而不仅仅是简单的基因敲除。为了克服这个限制，自然和工程CRISPR-Cas系统的工具箱得到了极大的扩展。现在已经开发出多种工具，能够在人类细胞中进行精确的基因组编辑和表观遗传工程。这些工具包括用于编辑非编码基因组、调节基因表达、进行精确基因改变以及针对传染性疾病治疗的方法。通过将CRISPR技术应用于这些领域，有望治愈许多以前无法治疗的疾病。这些进展为基因治疗提供了新的希望，将基因组工程推向更广阔的领域。然而，仍然需要进一步的研究和发展，以确保CRISPR技术的安全性和有效性，以实现其在临床应用中的潜力。

 引言

曾经认为适应性免疫是脊椎动物独有的特征。然而，我们后来发现原核生物也具有一种有针对性的免疫形式，这导致了一项可能彻底改变人类疾病治疗方式的技术的发展。这一突破始于对细菌基因组测序的早期研究，当时研究人员注意到大肠杆菌染色体中存在一种“不寻常的结构”，其中包含短的重复DNA序列。随后的研究在其他原核生物中发现了更多这样的结构模式，并于2005年对这些重复序列之间的序列进行了分析，被称为“聚类规律间隔短回文重复”（CRISPR），发现它们与噬菌体基因组完全匹配。进一步分析了这些重复间隔位点上游和下游区域，发现一组编码基因经常共定位于CRISPR阵列。这些编码基因被命名为CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）。在2007年的一项研究中报道了发酵乳菌（热带链球菌）表达Cas蛋白和包含与噬菌体基因组匹配的间隔序列可以免受噬菌体感染。值得注意的是，单一蛋白CRISPR相关蛋白9（Cas9）被确认为某些细菌中仅负责RNA介导的DNA切割。

这种CRISPR介导的噬菌体保护机制通过详细的生物化学工作被描述出来。CRISPR阵列被转录为单一的RNA，然后在重复处被处理成较短的CRISPR RNAs（crRNAs），每个RNA都含有一个间隔。crRNAs与一个小的反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）杂交，然后可以被Cas9识别和结合，形成一个核糖核蛋白（RNP）复合物。RNP复合物与噬菌体基因组结合，寻找与crRNA上编码的间隔物相匹配的序列。一旦发现同源性，Cas9就会发挥核酸酶的作用，通过切割DNA创造一个双链断裂（DSB），从而抑制噬菌体的生命周期。

这个简单的机制立即被认为是一种有希望的DNA编辑和治疗疾病的工具。为了简化CRISPR-Cas9系统并使其更适合基因编辑，crRNA和tracrRNA被合并成一个单一的导向RNA（sgRNA），形成了一个由两个部分组成的系统：Cas9蛋白负责创建双链断裂（DSB），而sgRNA则引导核酸酶定位到用户定义的基因组位点（见图1）。在哺乳动物细胞中，这个系统首先利用自然的DNA修复机制，通过更高效的非同源末端连接（NHEJ）和较低效的同源重组修复（HDR）过程进行基因编辑。NHEJ会导致容易出错的插入和删除（indel）形成，而HDR往往是更理想的治疗结果，因为它能够以精确的方式进行编辑。然而，许多疾病无法通过简单的基因敲除来治疗，需要更精细的基因组工程策略。

在本综述中，我们聚焦于CRISPR技术在治疗一些无法通过改变编码基因产生位移或提前终止来治愈的疾病方面的应用。我们概述了Cas蛋白的工程化改造和除了Cas9的其他CRISPR系统，这些系统为人类基因组的工程提供了一系列工具。然后，我们详细介绍了如何利用这些工具创造新的治疗方法，以治愈那些尚未被其他医学形式治愈的疾病。

CRISPR基因编辑

哺乳动物细胞已经进化出一条修复DSB的途径，即主要通过NHEJ连接受损链。在这个DNA修复过程中，核苷酸被插入或删除（indels），导致连接的DNA序列几乎随机突变，并对基因组产生永久性编辑。几十年来，开发锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）的研究表明，有能力利用NHEJ机制来克服哺乳动物细胞的遗传疾病。通过工程核酸酶靶向疾病驱动位点，可以通过引起移码突变来产生indel（插入缺失），从而实现基因敲除，或者通过随机indel修复突变来实现基因修复。生成针对特定位点的锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样酶效应器（TALENs）需要进行繁琐的设计、构建和测试周期，以确定能够选择性结合到所需基因组序列的氨基酸序列。由于从氨基酸变化准确预测DNA结合是困难的，因此精确靶向基因组位置可能具有挑战性。

CRISPR的靶向机制的简单性和可预测性使基因编辑从一个复杂的蛋白工程问题转变为一个RNA编码问题，使CRISPR立即成为基础研究和临床应用中引人注目的工具。这一进展导致了CRISPR相关出版物的爆炸性增长，并迅速导致基于CRISPR的治疗方法被用于临床前研究和早期临床试验，以应对多种定义明确的孟德尔病症。

一些针对单基因遗传疾病的CRISPR治疗已经进入临床试验阶段。例如，遗传性转甲状腺素蛋白(hATTR)淀粉样变性是一种罕见的致命性神经病变，全球约有5万人受到影响。该病以转甲状腺素蛋白（TTR）基因编码序列的点突变为特征，导致外周神经系统受损。这个无义突变引发蛋白质错误折叠，使转甲状腺素蛋白聚集成纤维，堆积在细胞外基质中并干扰正常细胞功能。为治疗这种疾病，研发了一种基于纳米颗粒的疗法，名为NTLA2001。该疗法将编码Cas9和针对TTR的sgRNA的mRNA封装在纳米颗粒中。当该疗法传递给患者时，Cas9-sgRNA核糖核酸蛋白复合物在TTR的编码序列中创建了一个双链断裂，导致基因发生位移突变，使突变基因失去功能。初步的I期临床试验结果显示，NTLA-2001可以显著降低TTR的表达，这对于减缓hATTR患者症状的进展可能非常有益。

在临床前模型中，已经使用基于CRISPR的疗法来治疗多种疾病，包括癌症、代谢性疾病和神经系统疾病等，利用基因敲除的方法进行治疗。然而，大多数疾病比单基因疾病更加复杂，无法通过简单编辑一个突变的等位基因来进行修复。为了治疗这些疾病，需要精确地纠正点突变，调整转录水平以挽救基因功能，或者进行更细致的非编码区编辑。下一代疗法将采用新型的CRISPR工具和方法，将该领域从基因编辑扩展到更广泛的基因组工程概念。

CAS工具箱

自从最初发现Cas9作为哺乳动物基因编辑器以来，两个关键的进展使得CRISPR技术能够扩展到具有复杂致病因素的疾病：将使用其他Cas蛋白的CRISPR系统引入哺乳动物细胞中，以及通过改造Cas分子来增强其功能。可用的Cas分子共同组成了一套基因组工程工具，为治愈超越野生型Cas9的疾病创造了机会。借助这个庞大的工具箱，可以选择适合特定疾病需求的CRISPR工具，而不是局限于适应Cas9现有能力的潜在疗法。

天然存在的CaS蛋白

目前存在两类不同的CRISPR系统，分别称为第一类和第二类（图2）。第二类CRISPR系统中的Cas蛋白（如Cas9）编码了目标识别和核酸酶功能的功能单元，这些蛋白属于一大类RNA导向核酸酶，在多种原核生物中发生了演化。其中，来自链球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9（简称SpCas9）和来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的Cas9（简称SaCas9）是最常用的两种Cas9蛋白。这些蛋白在不同的环境中经过演化，具有独特的特性，在应用于治疗时需要加以考虑。例如，所有已知的DNA靶向Cas蛋白都需要识别特定序列，称为原间隔相邻基序（Protospacer Adjacent Motif，简称PAM），以定位目标位点。PAM是在crRNA上没有编码的短DNA片段，Cas蛋白必须识别PAM序列才能开始解旋DNA并与目标结合。SpCas9需要识别相邻的NGG PAM，而SaCas9则识别NNGRRT PAM。除了影响DNA切割效率和特异性之外，PAM序列还是决定特定Cas蛋白可靶向编辑的基因组区域的重要因素。此外，Cas蛋白的大小也是需要考虑的关键因素之一。SaCas9的编码序列只有3.2 kb，明显小于SpCas9的4.1 kb，因此SaCas9更适合封装到基因传递载体（例如腺相关病毒-AAVs）中，因为这些载体通常有约4.7 kb的封装限制。因此，选择适合特定应用的Cas蛋白是非常重要的。

观察到II类系统具有独特特征后，研究人员开始在宏基因组水平中搜索新的CRISPR蛋白。利用天然原核生物CRISPR基因组的重复对称特征，通过分析原核生物的测序数据，找到了可能用于基因编辑的一系列Cas基因。这项工作导致了Cas12a的发现（最初被称为Cpf1），它能够在人类基因组中产生双链断裂（DSB）。Cas12a的PAM序列（TTTV）与SpCas9和SaCas9不同，使其能够靶向新的基因组位置，而且其大小比SpCas9小（Lachnospiraceae细菌的Cas12a约为3.7 kb）。最重要的是，Cas12a能够将CRISPR阵列加工成单个crRNA，从而通过从单个转录本中表达多个crRNA实现简便的多重靶向。相比之下，Cas9的多重靶向需要每个sgRNA都有自己的启动子，使得多个sgRNA的表达变得困难。这一发现催生了对新的Cas12蛋白进行发现和特性的研究，包括Cas12b、Cas12c、Cas12d（之前被称为CasY）、Cas12e（之前被称为CasX）、超紧凑型Cas12f（之前被称为Cas14，大小约为1.4-1.6 kb）、Cas12g、Cas12h、Cas12i和Cas12j（之前被称为CasΦ）。其中一些系统（如Cas12b、Cas12e、Cas12f和Cas12j）在人类细胞中显示出作为基因编辑器的潜力。

在2018年，发现了一类被称为Cas13的II类蛋白，具有结合和切割单链RNA的能力。Cas13机制类似于RNA干扰（RNAi），可以导致转录本的敲降，从而使特定mRNA被破坏，实现对转录组的有针对性改变。此外，许多Cas13蛋白可以灵活地靶向转录本，而无需特定的侧翼序列。这使得Cas13成为一种多功能工具，可以改变细胞的表型，而不会对基因组产生可遗传的改变。

I类CRISPR-Cas系统将其靶向和核酸酶功能分离到多个蛋白质中。例如，多蛋白复合物包含多个Cas5、Cas6、Cas7、Cas8和Cas11亚基，它们结合crRNA并将复合物定向到目标DNA。该复合物进一步招募Cas3来执行核酸酶功能。I类系统的大型、多组分性质给在人类细胞中的传递和表达带来了挑战，从而降低了其在基因编辑中的实用性。然而，较长的crRNA（因此具有更高的特异性）和I类系统的广泛多样性（超过80%已知的CRISPR系统属于I类）使其成为一个有吸引力的基因编辑选择。例如，级联复合物已被用于在人类胚胎干细胞中创建长程基因组缺失。

还发现了多种能够实现有针对性基因组插入的Cas蛋白。例如，一些I类CRISPR-Cas系统（如I-F型）和II类系统（如Cas12k）可以通过CRISPR介导的转座机制将DNA片段插入到特定位点。这种能力已在体外和原核生物宿主中进行了实验验证。虽然目前尚未将Cas介导的转座子引入人类细胞，但上述Cas系统以及其他已描述的Cas系统展示了CRISPR系统的广泛多样性和生物学功能。

改造过的Cas蛋白

随着CRISPR在原核生物中的演化，大多数Cas系统在人类细胞这样更复杂的基因组环境中的表达效果并不理想，导致编辑效率或特异性较差。蛋白工程的进展使得可以通过结构导向的突变、定向进化和噬菌体辅助进化等技术来开发改进的Cas蛋白。例如，对Cas12a和Cas12f的DNA结合口袋进行结构导向的工程改造增加了插入/缺失的频率，从而提高了人类基因组编辑的效率。值得注意的是，Cas12f已经被改造成一类超紧凑的Cas效应器（约1.4-1.6 kb），比其他Cas蛋白更适合在体内传递和表达。

为了将Cas应用扩展到基因组编辑以外的领域，去除了SpCas9的催化活性，生成了一个被称为dCas9的无核酸酶活性的蛋白质版本。这种工程将Cas9从一个RNA引导的核酸酶转变为一个RNA引导的结合蛋白。在大肠杆菌中，将dCas9定位到编码序列或其启动子并没有切割基因，但通过阻断RNA聚合酶抑制了转录过程。这种方法被称为CRISPR干扰（CRISPRi），它深刻改变了CRISPR的应用方式，并催生了一系列基因编辑和基因调控的CRISPR技术。

将CRISPRi引入哺乳动物细胞通常仅通过将dCas9定位到编码序列是不足以阻断转录的。为了在哺乳动物细胞中实现基因敲降，需要将dCas9与一个抑制性结构域（例如Krüppel相关盒，KRAB）融合，当其靠近特定基因座时诱导局部基因抑制（图3a）。在这种情况下，dCas9定位到精确的基因组位置，将融合的KRAB结构域定位，只在dCas9-KRAB融合蛋白结合的地方抑制基因表达。自从这一发现以来，已经生成了许多融合蛋白，扩展了表观基因组工程的工具箱。此外，无核酸酶活性的Cas蛋白质也可以与转录激活因子融合，通过一种被称为CRISPR激活（CRISPRa）的方法上调特定基因的表达。首个CRISPRa的示例是将VP64（四个串联重复的疱疹病毒VP16结构域，可以诱导转录）融合到dCas9上，并靶向位于启动子附近的区域，从而在哺乳动物细胞中上调特定基因的表达。随后，dCas9与多种转录激活结构域融合，包括RTA、VP64、HSF1和p65，可以实现多个细胞类型中的高度特异性基因上调（图3b）。表观遗传学的DNA修饰结构域，包括DNA甲基化结构域DNMT3A和DNMT3L，以及DNA去甲基化结构域TET，也可以与dCas9融合。此外，写入H3K27乙酰化或甲基化、H3K4甲基化、H3K9甲基化或H3K79甲基化的组蛋白修饰因子，可以单独或组合融合，以写入或擦除组蛋白表观基因组的变化。这些CRISPR介导的表观遗传学修饰可以重新编程转录组，实现长时间的靶基因的沉默或激活，相较于传统的CRISPRi或CRISPRa，具有更多的新功能。

其他CRISPR-Cas系统也可以突变成dCas系统，以利用其独特的特性。例如，dCas12a的crRNA处理功能可以实现高度多重的CRISPRa或可诱导的逻辑门控基因调控。将dCas13与RNA修饰结构域（如将A转化为I的ADAR脱氨酶结构域）融合，可以实现针对编码区或表观转录组的靶向性改变，从而可以研究其对细胞表型的影响。

除了转录调控或表观遗传外，Cas蛋白还可以与核苷酸修饰酶融合，实现精确的基因编辑。尽管DSB介导的插入缺失（indel）形成对基因敲除很有用，但插入缺失的随机性使得这种机制难以用于精确的突变修正。为了克服这一限制，DNA碱基编辑酶已经与dCas和产生单链断裂的突变核酸酶版本（nCas）融合。例如，当与dCas9融合时，胞嘧啶脱氨酶酶APOBEC1可以在未被sgRNA绑定的DNA链上实现有针对性的C到U转换。在DNA复制过程中，这个U被识别为T，从而产生精确的C到T突变（图3f）。通过将dCas9换为nCas9、融合尿嘧啶DNA糖苷酶（UGI）、突变APOBEC1或者替换为其他胞嘧啶脱氨酶以及优化胞嘧啶脱氨酶和Cas蛋白的连接部分，已经可以极大地改进胞嘧啶碱基编辑（CBE）系统。

将Cas9与经过蛋白质进化优化的大肠杆菌TadA融合后，可以使腺嘌呤（A）被脱氨酶作用转化为次黄嘌呤（I），从而实现A到G的转换（图3g）。通过对TadA进行连续的改进以及用噬菌体辅助TadA进化，添加额外的TadA结构域，改进密码子的使用和核定位等方法，进一步改进了腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）。为了在单一位点同时实现胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）和腺嘌呤（A）到鸟嘌呤（G）的转换，可以将胞嘧啶和腺嘌呤脱氨酶都融合到nCas9中。

碱基编辑可以在靠近Cas结合区的区域产生特定的突变，但不足以进行多个碱基对的插入、删除或超出A到G或C到T的突变。此外，如果目标位点周围存在许多A或C，它们可能无意中成为突变，产生非目标效应。为了克服这一限制，已经开发了一种插入更长的DNA片段的方法，称为primer编辑（FIg. 3h）。在这种方法中，nCas9与一种反转录酶融合，而sgRNA的3'端被延长，编码所需的插入或删除序列以及与被切割的DNA互补的引物区域（统称为prime editing guide RNA，pegRNA）。pegRNA作为引物作用于被切割的链，而反转录酶直接将所需的设计转化为DNA，直接在基因组中进行目标插入或删除。Prime editing最初用于进行12种碱基之间的转换，最多可插入44个碱基和1到80个碱基的删除。通过使用两个pegRNA，可以创建更大的基因替换或切除策略，从而实现针对性的插入，例如用于大片段基因组插入（最多几千个碱基对）的Bxb1重组酶位点。

以非编码基因组为目标

通常情况下，仅通过插入/缺失突变引发基因的移码或引入过早终止密码子，并不能完全克服疾病的驱动因素。许多疾病的驱动因素存在于基因组的非编码区域，例如调节转录的启动子或增强子，以及影响mRNA剪接和蛋白质翻译的内含子。因此，利用这些非编码位点来调控基因表达提供了新的治疗机会，而无需改变基因的主要序列。人类基因组中的大部分区域都是非编码的，借助CRISPR技术，我们可以在这个广阔的空间中进行基因组和表观遗传学的调整，从而影响基因的调控。

内含子

mRNA中包含可以调控翻译的调控元件，但它们本身并不编码蛋白质。内含子区域的突变可能导致前体mRNA的错误剪接，进而产生错误翻译的蛋白质，从而引发疾病。例如，一种罕见的儿童失明症状，称为Leber先天性色盲10型(LCA10)，其特点是CEP290基因内含子的点突变，导致光感受器功能异常，最终导致视网膜退化。这种突变导致CEP290前体mRNA发生异常剪接，引入过早的终止密码子，从而产生截短的蛋白质并丧失功能。作为基因治疗，添加CEP290互补DNA（cDNA）可以纠正基因剂量，理论上可以治愈该疾病；然而，CEP290蛋白质很大（2,479个氨基酸），无法装入腺相关病毒（AAV）等病毒载体中，因此无法作为基因治疗使用。为了克服这个问题，正在开发一种基于AAV5的治疗方法，称为EDIT-101，它包装了SaCas9和两个针对CEP290内含子点突变上游和下游基因组位置的sgRNA。这两个sgRNA能够在突变周围进行切割，诱导其去除或逆转，从而恢复CEP290前体mRNA的正常剪接（图4a）。

内含子靶向也被用于临床前研究中来纠正β-地中海贫血，这是一种由HBB基因中的多种突变引起的遗传性血液疾病。其中，在东南亚人群中尤为常见的一种致病HBB突变是位于内含子2的点突变（IVS2-654），它会影响剪接过程。研究人员通过将Cas9靶向到异常的内含子位置，成功地在体外诱导的多能干细胞（iPSCs）中恢复了HBB基因的表达，为通过造血干细胞替代进行细胞治疗提供了潜在的途径。类似地，研究人员还将CRISPR-Cas9靶向到LZTR1基因的内含子16，可以在体外培养的iPSC-衍生心肌细胞中克服与Noonan综合征相关的心肌病表型。这种内含子靶向的方法也在体外实验中被用于修复导致囊性纤维化的CFTR基因罕见突变，全球范围内该疾病影响约2,000名患者。

CRISPR-Cas可以利用外显子跳跃的过程来删除整个外显子。这种方法是通过将Cas9靶向到包围突变外显子的内含子上，改变前mRNA的处理过程，使异常的外显子被剪接掉，从而保持完整的开放阅读框架，同时去除突变（见图4b）。这个方法已经在体外应用于杜兴肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy）的研究中，这是一种以肌肉萎缩为特征的疾病，由于突变导致了dystrophin基因（DMD）的外显子50的缺失。为了纠正这个缺失，可以通过靶向DMD基因的外显子50的剪接受体位点、外显子51周围的内含子或者DMD基因的外显子45-55周围的内含子来利用外显子跳跃进行修复。无论哪种情况，外显子51的恢复都可以恢复DMD基因的功能，克服疾病的病理过程。双重靶向的CRISPR-Cas9外显子跳跃方法也可以用于靶向融合癌基因。这种方法已经被用来开发针对特定癌症的疗法，在小鼠异种移植模型中控制肿瘤负荷。

非翻译区域

mRNA的非翻译区域（UTR）包含调控元素，这些元素位于翻译起始和终止位点之间。这些区域具有多种调控功能，例如启动和终止翻译过程、改变RNA的运输和稳定性、与RNA结合蛋白或微小RNA（miRNA）相互作用，以及控制转录后修饰。通过靶向UTR来克服疾病病理过程的方法已在体外实验中得到证明。例如，在健康细胞中，DM1蛋白激酶（DMPK）的3' UTR中CTG重复序列的扩增会导致神经肌肉障碍，称为肌无力型营养不良1型（DM1）。通过CRISPR-Cas的有针对性删除，可以在DM1神经干细胞中消除异常的mRNA转录产物。

在患有杜氏肌营养不良的患者诱导多能干细胞（iPSCs）中，通过上调与肌营养不良相关的基因UTRN，可以克服DMD基因失活的影响。然而，结合到UTRN上的miRNA会破坏其转录产物。因此，通过使用Cas9靶向miRNA结合位点，可以消除miRNA的作用，从而增加UTRN蛋白的表达，克服疾病的表型。

表达亨廷顿病相关的亨廷顿基因（HTT）会导致神经退行性疾病的发生。为了以一种与突变无关的方式敲除这个基因，可以将Cas9靶向HTT的5' UTR，导致转录本的不正确成熟并降低疾病相关等位基因的表达。同样地，在阿尔茨海默病的小鼠模型中，破坏淀粉样前体蛋白3' UTR中的一个52个碱基的调控元件，可以大幅减少引发该疾病的淀粉样-β肽（Aβ）的产生。

顺式调控元件

启动子、增强子和沉默子等顺式调控元件是重要的调控区域，通过调控和改变编码基因的表达来发挥作用。在这些区域创建插入/缺失突变会破坏它们的功能，并可用于纠正导致疾病的基因剂量。例如，镰状细胞贫血（SCD）和输血依赖型β-地中海贫血（TDT）是由HBB基因突变引起的单基因疾病，导致HBB蛋白形态异常和功能丧失。编码胎儿血红蛋白（HbF）的γ-球蛋白基因（HBG1和HBG2）在成年过程中被转录因子BCL11A抑制。一种名为CTX001的离体基因编辑技术已经被开发出来，通过降低BCL11A的表达来上调自体造血干细胞和前体细胞中的HBG。该技术利用CRISPR编辑BCL11A增强子来降低基因表达，而不是完全消除BCL11A，因为完全消除会导致其他病理变化（图4a）。这种“一刀切”的治疗策略可能比针对HBB的众多个体突变之一进行纠正的特定策略更有潜力造福更多患者。

编辑顺式调控元件的治疗潜力也正在其他疾病中进行研究。例如，突变的转录因子FOXA1是一个与前列腺癌的发生和发展相关的癌基因。通过靶向FOXA1启动子中的转录因子结合位点，调节这些元件的功能，降低基因表达并抑制体外前列腺癌细胞的生长。此外，在体外研究中，采用双sgRNA方法切除了突变HTT基因上游的一个44 kb启动子区域，使其表达沉默，从而消除了引起亨廷顿病的变异体的表达（图4d）。类似地，一种双靶向方法在HTT基因的启动子和第一个内含子中分别结合一次，去除了转录起始位点和第一个外显子，从而抑制基因表达。

非编码RNA

一些非编码RNA通过Watson-Crick碱基配对与mRNA结合来影响基因表达，这为通过基因编辑改变基因表达创造了另一条途径。例如，miRNAs可以与UTRs结合，并以它们为目标进行破坏。长非编码RNAs（lncRNAs）可以通过几种机制发挥作用，包括激活或抑制转录或翻译，改变剪接或重塑染色质表观遗传学。改变非编码元件的主要序列会消减其功能和对基因表达的下游影响。

安吉曼综合征是一种由母系遗传的突变UBE3A基因引起的神经发育障碍，可以通过父系等位基因的表达而得到拯救。然而，父系等位基因被lncRNA UBE3A- ATS所沉默。CRISPR-Cas9靶向UBE3A- ATS消减了其功能，导致父系UBE3A基因的表达，并在培养的人类神经元和该疾病的小鼠模型中拯救了疾病表型。

CRISPR介导的lncRNA通过插入/缺失突变诱导的敲除已经在癌症体外研究中得到广泛研究，以减少细胞生长并克服转移。利用Cas13系统介导的mRNA敲减已在膀胱癌的体外和体内实验中应用，通过切割lncRNA来抑制膀胱癌的增殖。

肌肉萎缩部分受miR-29b表达的调控。在多个肌肉萎缩小鼠模型中，通过递送针对miR-29b的Cas9，成功敲除该miRNA，并有效预防肌肉丧失（图4f）。在巨噬细胞系中，利用CRISPR介导的miR-155的插入缺失，在体外成功降低了促炎细胞因子的表达水平，为治疗自身免疫性疾病类风湿性关节炎提供了一种潜在途径。此外，在癌症领域，miRNA的靶向治疗也得到了广泛的研究。各种方法在临床前研究中表现出减少癌细胞增殖、抑制转移以及诱导癌细胞死亡的潜力。

转录和表观遗传调控

许多疾病是由于表观遗传变化和基因剂量的异常表达所驱动，这种情况不能仅通过插入缺失或微缺失的方式来简单地修复。此外，异常表达有时也可以由于一种野生型CRISPR系统无法介入的表观遗传变化引起。为了弥补这一缺陷，可以创造性地将dCas蛋白与转录调控因子或表观遗传修饰因子相结合，以精确地靶向基因组的特定区域的治疗调控元件，而无需造成DNA损伤或进行DNA编辑。这种方法还有助于减少与DNA损伤、p53诱导的细胞凋亡、长期的非特异性编辑和异常染色体重排等风险相关的问题。

CRISPR干扰

dCas9-KRAB融合蛋白可以被定向到蛋白编码序列，通过下调转录来抑制基因表达，只要CRISPR融合蛋白存在，基因表达就会持续受到抑制，而不会对DNA进行永久性编辑。这个特性在降低外周神经系统中电压门控钠离子通道NaV1.7（由SCN9A基因编码）的表达方面具有吸引力，从而减轻疼痛，减少对阿片类药物的依赖。由于开发小分子药物具有一定挑战性，并且完全抑制该基因会导致永久性的疼痛不敏感，因此CRISPRi是治疗慢性疼痛的一种有吸引力的选择。通过将CRISPRi定向到NaV1.7，并通过腰椎内途径输送，可以降低疼痛敏感性，并在小鼠模型中逆转由卡拉胶引起的炎症性疼痛、紫杉醇引起的神经病理性疼痛和BzATP引起的疼痛，显示了CRISPRi在这些情况下相对于传统CRISPR编辑的治疗优势。

CRISPRi的调控效应可以应用于许多其他疾病中，其中完全通过CRISPR介导的基因敲除在治疗上并不具备实用性。在一种长QT综合征（LQTS）中，该病可以由CALM2基因的多种突变引起，利用dCas9-KRAB可以在体外降低突变基因的表达。这种干预措施在iPSC衍生的心肌细胞中克服了疾病表型，并创造了一种适用于各种无义突变位置的通用治疗方法。在视网膜色素变性的小鼠模型中，将dCas9-KRAB靶向Nrl基因可以在传递给有限DNA修复机制能力的有丝分裂后细胞时拯救视网膜功能。DUX4在肌肉细胞中的过度表达导致了肩胛带-肱骨肌萎缩症（FSHD）。由于DUX4存在多个基因组副本，如果大量引发双链断裂（DSB），可能会产生毒性，并且在这种大规模重复区域进行基因编辑可能导致不可预测的结果。CRISPRi已被用于体外和体内研究中，以降低DUX4的表达，而无需担心因DNA损伤而引发的细胞凋亡风险。与CRISPR基因编辑相比，CRISPRi具有可诱导和可逆的特点，进一步减轻了在临床测试中的安全性顾虑。

CRISPR激活

将dCas蛋白与激活因子融合提供了一种针对性基因上调的方法，可以克服各种类型的疾病，包括由于单等位基因不全引起的疾病。与异位转基因表达不同，CRISPRa可以精确调节基因上调的程度。此外，与较大的转基因相比，这个系统可以更容易地封装到病毒载体中。例如，无核酸酶活性的SaCas9（SadCas9）与VP64结构域融合，并传递到具有Sim1或Mc4r单等位基因不全的肥胖症小鼠模型中。将CRISPRa靶向启动子区域增加了这两个基因的转录，拯救了肥胖表型，并通过精确靶向组织特异性的顺式调控元件，展示了细胞特异性。

CRISPRa技术可以独立于基因突变而上调基因表达。多个LAMA2基因的突变导致先天性肌萎缩型1A（MDC1A），而通过外源表达LAMA1基因可以挽救该疾病。研究中使用基于AAV的载体，将SadCas9蛋白与VP64融合，将其传递至MDC1A小鼠模型中，成功上调Lama1基因表达，改善了肌肉纤维化并阻止了疾病的进展。此外，通过上调Lama1或utrophin基因（UTRN），也能在体外实验中克服Duchenne肌萎缩症的表型。在小鼠实验中，通过将Cas9蛋白与包含p65和HSF1结构域的aptamer的sgRNA结合，可以上调特定基因的表达，用于治疗Duchenne肌萎缩症（如Klotho或Utrn）、急性肾损伤（如Il10或Klotho）和1型糖尿病（如Pdx1）。值得注意的是，该sgRNA的间隔序列长度为14个碱基，而非常规的20个碱基，这使得Cas9蛋白能够结合到DNA上，但不会造成双链断裂，从而形成了一个无核酸酶的系统。

CRISPRa技术在体外实验证明了在自身免疫性疾病、神经退行性疾病和癌症等方面上调治疗性编码基因的有效性。然而，这种方法的应用不仅局限于单一蛋白质的上调，还可以用于上调内源性的非编码RNA。例如，将dCas9与VP64、p65和RTA融合（统称为VPR），已经在体内使用来增加DANCR的表达，该lncRNA通过软骨形成分化促进骨再生。CRISPRa还可以通过添加多个sgRNA来同时上调多个基因靶点。例如，CRISPRa在体外实验中展示了在脂肪来源干细胞中同时上调Bdnf、Gdnf和Ngf基因的能力，以促进大鼠神经损伤模型中的周围神经再生。

传统的CRISPRi和CRISPRa结构很大，难以包装成单一的AAVs；然而，超紧凑CaS分子的开发可以克服这一问题。例如，对一个天然的Cas12f系统进行结构改造，将CAS的大小减少了近60%(2.6kb)，以产生一个微型的CAS系统(CasMINI，~1.55kb)。CasMINI可以与许多常用的激活或抑制调节剂融合，产生比AAV载体在体内传递的4.7kb包装限制小得多的蛋白质。这些超紧凑系统也可以编码在mRNA上，以便在人体组织和体内更有效地传递和表达。

CRISPR表观遗传修饰

CRISPRa和CRISPRi基因调控方法可以实现短期的基因调节。在有丝分裂后的细胞或需要短暂基因表达调控的疾病中，这种短暂性并不构成问题。然而，一些疾病需要长期且可遗传的基因调控变化。通过向DNA添加甲基基团或在组蛋白残基上插入乙酰基或甲基基团，可以在局部调控基因表达的同时进行表观遗传修饰。这些修饰通常具有持久性，并且可以通过子细胞传递，为长期的基因表达调控提供了机会。许多表观遗传修饰因子已经与CRISPR蛋白融合，以在DNA或染色质水平上实现化学修饰。例如，CRISPRoff和CRISPR-KAL通过修饰H3K9me3和DNA甲基化实现了长期（数月）的基因沉默。这些方法可能适用于需要持续基因调控的疾病治疗。

将来自DNMT3家族的DNA甲基化结构域与dCas9融合，可以实现长期的基因沉默。例如，将dCas9-DNMT3融合蛋白靶向SNCA内含子1，在携带SNCA三倍体的人类iPSC来源的多巴胺能神经元中生成靶向DNA高甲基化，从而在体外挽救了帕金森病相关的表型。为了逆转自然DNA甲基化的沉默效应，将十一转位甲基胞嘧啶二氧化酶1（TET1）催化结构域与dCas9融合，可以选择性地去除DNA甲基基团并上调基因表达。这种方法已被研究作为治疗脆性X综合症的潜在疗法，该综合症是由FMR1基因中CGG重复扩增引起的智力障碍，导致广泛的甲基化，从而降低基因表达。将dCas9-TET1靶向FMR1可以去甲基化CGG重复序列，重新激活持久的基因表达，并在体内iPSC来源的神经元中挽救疾病表型。包含dCas9和TET酶催化结构域的融合蛋白也已被用于体外治疗癌症（靶向BRCA1）和体内治疗（靶向SARI），并在体内减轻肾脏纤维化（靶向Rasal1或Klotho）。重要的是，由此产生的DNA甲基化变化是持久的、可遗传的和可逆的。

为了定点修饰组蛋白，p300结构域的催化核心被融合到dCas9上。当指向DNA上的增强区时，这种融合会在组蛋白H3的赖氨酸27上增加一个乙酰基团（H3K27ac），导致基因表达的激活。在小鼠中，dCas9-p300的表达能够上调T细胞中Foxp3的表达，将其转化为调节性T（Treg）细胞，具有治疗自身免疫的潜力。使用与组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）融合的dCas9可以去除H3K27ac标记。这种方法已经针对KRAS来抑制癌症生长。其他抑制性CRISPR组蛋白修饰剂包括减少H3K4甲基化，增加H3K9甲基化和增强HP1α结合，当靶向GRN时，可以减少肝癌细胞的增殖和侵袭。

Base and prime editing

除了细胞疗法外，野生型CRISPR系统往往是精确突变纠正的不良选择，因为添加的核苷酸的数量或特性无法控制。为了填补这一空白，已经产生了能进行精确基因改变的CRISPR融合形式，并在无数种疾病中得到应用。

Base editing

随着技术的迅速进步和对有害点突变进行无与伦比精确修复的能力，碱基编辑技术（base editors）被迅速应用作为治疗已知错义突变相关的明确疾病的潜在方法。能够创建C到T突变的CBE已被广泛用于各种体内模型中。Cas9和Cas12a的CBE已被用于修复Pah基因的错义突变，该基因存在于人类常染色体隐性肝脏疾病苯丙酮尿症（PKU）的小鼠模型中。C到T转换的能力使得产生终止密码子成为可能，终止密码子总是以胸腺嘧啶（thymine）开头。在肌萎缩侧索硬化症（ALS）的小鼠模型中，使用SpCas9 CBE在SOD1基因中创建一个过早终止密码子，减少了肌肉萎缩并改善了神经肌肉功能。由于CBE CRISPR构建的体积较大，需要将蛋白质分割成两个AAV载体，并在细胞内使用肽内切酶进行翻译后融合。

ABEs与治疗方法高度相关，因为在所有已知的致病点突变中，C-G到T-A的转换约占一半。在杜氏肌肉萎缩症小鼠模型中，以两个AAVs形式传递到肌肉的ABEs能够纠正杜氏肌肉萎缩症的一个突变，并改善疾病表型。ABEs也被用来纠正哈钦森-吉尔福德早衰综合症小鼠模型中的LMNA突变，将中位寿命从215天延长到510天。值得注意的是，使用ABE来纠正镰状细胞病小鼠模型中的无义突变，导致该疗法的BEACON-101 I/II期试验获得批准。基因编辑的其他治疗用途已在其他地方进行了回顾。

Prime editing

Prime editing具有广泛的治疗基因组编辑潜力，但与其他CRISPR系统相比，其研究尚不如其他方法广泛。在首次描述该技术的研究中，研究人员成功纠正了导致镰状细胞贫血症的HBB基因突变、导致Tay-Sachs病的HEXA基因突变以及保护免疫性蛋白疾病的PRNP基因。Prime editing能够进行精确的基因突变，这是使用基因碱基编辑器目前无法实现的。例如，在α1-抗胰蛋白酶缺乏症（AATD）小鼠模型中，研究人员通过创建A到G的基因编辑，成功将prime editing技术应用于小鼠肝脏中，纠正了SERPINA1基因中的致病性E342K突变。此外，研究人员还利用prime editing技术在小鼠视网膜中纠正了Dnmt1基因的突变，通过创建G到T的基因转换，展示了该技术纠正眼部疾病的潜力。这些精确的基因编辑通过其他CRISPR工具无法实现。

除了基因碱基编辑，prime editing还可以用于插入寡核苷酸。在人类诱导多能干细胞（iPSCs）中，利用prime editing技术将两个核苷酸（AC）插入到DMD基因的第52外显子中。这种方法使得外显子重构可以恢复DMD的表达，并改善模拟杜氏肌营养不良症的iPSC-来源心肌细胞的收缩功能。尽管prime editing技术在治疗上仍处于起步阶段，但这种方法创造的基因组编辑的灵活性潜在地能够纠正许多疾病。

感染的预防和治疗

除了对人类基因组进行修改，CRISPR-Cas治疗方法还可以用于靶向人体细胞中的潜伏性和慢性病毒感染。例如，在小鼠模型中，通过将Cas9作为非整合性慢病毒进行角膜内注射，可以预防单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染并减轻疾病病理，并且可以消除病毒的隐藏库。此外，通过将Cas9定位到病毒基因组的重要启动子或编码序列，该系统也可以用于其他疱疹病毒，如Epstein-Barr病毒（EBV）。研究人员已经利用Cas9和Cas12a来靶向HIV-1的长末端重复序列和Gag-Pol多蛋白。对于乙型肝炎病毒（HBV），Cas9可以靶向其编码序列和共价闭合的环形DNA，而对人乳头瘤病毒（HPV），Cas9可以切割其DNA基因组。此外，通过使用具有修改的sgRNA的Cas9，可以破坏丙型肝炎病毒（HCV）的RNA基因组。值得一提的是，一种基于CRISPR的清除HIV感染的策略（EBT-101）已经进入了I/II期临床试验。此外，作者的实验室还开发了一种利用Cas13d靶向病毒RNA基因组的策略，该策略在预防流感A病毒（IAV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）感染方面展示了良好的效果。值得注意的是，该策略可以广泛靶向冠状病毒和SARS-CoV-2的变种，因为其可以针对病毒基因组中高度保守的区域进行作用。

CRISPR也被用来针对细菌感染。Cas9可以被包装成噬菌体，并传递给具有抗生素抗性的金黄色葡萄球菌，以锁定细菌的抗性基因，使细菌重新对治疗敏感。由于细菌基因组中的DSB会导致细胞死亡，质粒或噬菌体传递的Cas9在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中都是一种有效的抗菌策略。Cas3已被用于靶向和粉碎（即创建长程缺失）艰难梭菌（也称为艰难梭菌）的基因组，这是现有的最有害和耐抗生素的细菌物种之一。庞大的治疗性CRISPR工具箱正在迅速扩展到人类基因组工程之外，以治疗各种各样的传染病。

递送CRISPR工具的挑战

CRISPR系统是由多个组分组成的，需要将大型蛋白质、gRNA以及控制它们表达的所有元素进行封装。已经有许多成熟的方法用于将这些组分作为DNA、RNA或RNP复合物进行体外和体外递送。整合和非整合性 lentivirus 都可以用于传递 CRISPR 组件，但由于插入性突变的潜在风险和低效性等原因，其受到限制。DNA、RNA或RNP也可以通过电穿孔或微注射等物理方法将组分引入细胞中。这些方法具有可控的剂量和高效的递送，但在技术上可能具有一定的难度，并可能引起细胞存活性问题。

许多可能从CRISPR疗法中受益的疾病无法进行体外治疗，因此无法使用慢病毒、微注射或电穿孔等方法进行递送。体内递送CRISPR分子是一个主要的挑战，限制了其作为治疗药物的潜力。腺相关病毒（AAV）常被用于将CRISPR组分作为DNA进行体内和体外递送。这种方法可以将小型CRISPR系统作为单个载体进行递送，或将较大的组分分散在多个载体中。然而，AAV的包装容量有限，且只对特定组织具有亲和性，因此无法被普遍使用。脂质纳米颗粒（LNPs）可以将CRISPR工具作为RNA递送，与病毒AAV递送相比，结果更具短暂性效应，从而降低了非特异性编辑的风险。然而，许多LNPs几乎只在肝脏中存在，并无法到达其他治疗相关的组织。类病毒颗粒（VLPs）是CRISPR组分递送的激动人心的载体。一个RNA结合蛋白或CRISPR RNP与逆转录病毒Gag-Pol融合，使CRISPR RNA或RNP被封装在病毒载体中。尽管VLP的治疗应用仍处于初级阶段，但已经证明该方法具有较低水平的非特异性效应和灵活的亲和性。

目前的CRISPR治疗受到可用递送载体的小包装容量和组织转运特性的限制，这限制了这些CRISPR工具的应用范围，降低了潜在的治疗疾病的可能性。为了提高体内递送载体的疗效、安全性和特异性，科学家正在研究各种方法，包括AAV外壳的定向进化、LNPs的功能化以及CRISPR组分的分子工程等。通过这些努力，希望能够实现高效、高特异性和最小毒性的体内递送，以充分发挥CRISPR疗法的潜力。

总结

CRISPR作为一种广泛应用于克服遗传性疾病的工具，其优势在于能够轻松创建针对人类基因组的有针对性双链断裂（DSB）。首先，CRISPR被用于进行有针对性的基因敲除，因为Cas9可以定位于编码序列的任何位置，诱导产生框架转移以使有害蛋白质失活。然而，大多数疾病都很复杂，无法通过简单的编码序列靶向策略来治愈。为了针对具有复杂驱动因素的疾病，研究人员通过开发更为细致的策略来推动CRISPR的应用，这些策略针对非编码基因组，通过外显子跳跃或内含子修正等间接方式调整基因表达。除了这些方法，还通过快速发现具有有益特性的天然CRISPR分子，并对这些蛋白质进行进一步的工程设计，创造出能够改变转录、改变表观基因组、进行精确突变或直接在基因组上进行书写的分子，大大增加了可能使用CRISPR-Cas系统治疗的适应症范围。然而，要充分发挥这些蛋白质的作用，还需要进一步取得突破。

正如上述所述，目前的CRISPR工具受到将治疗分子有效传递到相关组织的挑战的限制。此外，为了创建高度靶向的治疗，必须精确控制CRISPR系统引起的非特异性事件。通过生物信息学策略来提高gRNA的特异性，改变gRNA的化学组成和长度，发现和改造新的Cas变体，使用短暂传递方法或抗CRISPR技术对CRISPR系统进行时间限制，以及从双链断裂（DSB）转向更为精确的系统（如Prime Editor、Base Editor或表观遗传修饰因子）都可以大大减少非特异性效应。然而，还需要进行更多的研究，以开发出最安全有效的CRISPR治疗方法。

将CRISPR工具用于更复杂的疾病驱动因素需要更好地了解非编码DNA和表观遗传状态如何影响疾病病理。与非编码序列的突变相比，编码序列中的点突变更容易与疾病表型相关联，因为我们对遗传变化导致氨基酸变化的机理有深入的了解，可以通过测序信息进行研究。选择合适的CRISPR工具，能够将序列、表观基因组、转录组和表型信息与复杂病理的根本原因相关联，对于开发新的治疗方法具有重要意义。然而，CRISPR工具、多组学方法和传递机制的快速进展表明，基因组工程技术很快将用于治疗多种疾病，有望为许多未得到满足的患者群体提供治愈性疗法。