前言
做生分析有时候需要从基因组fasta文件中提取基因的序列，对于这个需求有不少现成的软件可以来实现，今天来跟大家分享4款可以完成这个需求的软件，废话不多说了，直接来看看是哪4个软件：seqkit、seqtk、bedtools、gffread，这四个软件本身功能都很丰富且实用，提取序列只是软件的功能之一。前面两款功能很类似，这个从它们的名字也可以看出来，功能有些冗余实际实用时选择其中一款即可。bedtools应该很多人都用过，这个软件主要是用来操作bed文件，可以对两个bed进行交集、并集等，gffread单独拿出来有些人可能不知道，如果说cufflinks很多人可能就知道了，gffread就是cufflinks工具集中的一个子软件，它还用一个常用的功能就是gtf、gff格式互转。那下面我们就来看看四款软件的具体使用方法。
- seqkit
首先来看一下seqkit使用方法，该软件的功能很多(可使用seqkit -h来查看全部可用命令)，提取序列使用的是subseq子命令，该命令可以根据bed、gtf、region位置信息从fasta文件中提取基因序列，并且可以扩展两侧的序列，具体代码如下：
Usage:
seqkit subseq [flags]
Flags:
--bed string by tab-delimited BED file
--chr strings select limited sequence with sequence IDs when using --gtf or --bed (multiple value supported, case ignored)
-d, --down-stream int down stream length
--feature strings select limited feature types (multiple value supported, case ignored, only works with GTF)
--gtf string by GTF (version 2.2) file
--gtf-tag string output this tag as sequence comment (default "gene_id")
-h, --help help for subseq
-f, --only-flank only return up/down stream sequence
-r, --region string by region. e.g 1:12 for first 12 bases, -12:-1 for last 12 bases, 13:-1 for cutting first 12 bases. type "seqkit subseq -h" for more examples
-u, --up-stream int up stream length
Global Flags:
--alphabet-guess-seq-length int length of sequence prefix of the first FASTA record based on which seqkit guesses the sequence type (0 for whole seq) (default 10000)
--id-ncbi FASTA head is NCBI-style, e.g. >gi|110645304|ref|NC_002516.2| Pseud...
--id-regexp string regular expression for parsing ID (default "^(\\S+)\\s?")
--infile-list string file of input files list (one file per line), if given, they are appended to files from cli arguments
-w, --line-width int line width when outputing FASTA format (0 for no wrap) (default 60)
-o, --out-file string out file ("-" for stdout, suffix .gz for gzipped out) (default "-")
--quiet be quiet and do not show extra information
-t, --seq-type string sequence type (dna|rna|protein|unlimit|auto) (for auto, it automatically detect by the first sequence) (default "auto")
-j, --threads int number of CPUs. (default value: 1 for single-CPU PC, 2 for others) (default 2)
#提取序列
seqkit subseq --bed gencode_lncrna.bed -o test.fa GRCh38.primary_assembly.genome.fa
可以看来seqkit提取序列还是很方便的，而且可以分别指定上下游延申多少bp的侧翼序列，或者只提取上下游序列也是可以的，还可以指定输出文件的宽度，更多细节功能这里就不多说了。
- seqtk
下面来看一下seqtk的功能，这个软件根据bed文件来从fasta中提取序列，从下面的代码可以看出这个软件的子命令参数很少，通过重定向的方式输出到新的文件里，用起来很简单。
Usage: seqtk subseq [options] <in.fa> <in.bed>|<name.list>
Options: -t TAB delimited output
-l INT sequence line length [0]
#提取序列
seqtk subseq GRCh38.primary_assembly.genome.fa gencode_lncrna.bed >test.fa
- bedtools
bedtools功能很多，非常出名的功能是用来对bed文件取交集等一系列操作，那些功能这里就不多说了，感兴趣的可以自己去测试。可以看出该软件可以根据bed、gff、vcf位置来从fasta中提取序列，下面来演示一下该软件如何提取序列。
Usage: bedtools getfasta [OPTIONS] -fi <fasta> -bed <bed/gff/vcf> -fo <fasta>
Options:
-fi Input FASTA file
-bed BED/GFF/VCF file of ranges to extract from -fi
-fo Output file (can be FASTA or TAB-delimited)
-name Use the name field for the FASTA header
-split given BED12 fmt., extract and concatenate the sequencesfrom the BED "blocks" (e.g., exons)
-tab Write output in TAB delimited format.
- Default is FASTA format.
-s Force strandedness. If the feature occupies the antisense,
strand, the sequence will be reverse complemented.
- By default, strand information is ignored.
-fullHeader Use full fasta header.
- By default, only the word before the first space or tab is used.
#提取序列
bedtools getfasta -fi GRCh38.primary_assembly.genome.fa -bed gencode_lncrna.bed -name -fo test.fa
该软件提取序列时，可以根据基因链的信息来提取序列，这个功能有时候很实用。同时这个软件的速度也是非常的块。
- gffread
gffread是cufflinks软件集中的一个子软件，该软件另一个常用的功能是gtf、gff格式互转，感兴趣的可以自己测试。这个软件的参数非常多，这里就不展示了。这款软件可以根据gff、gtf位置信息来从fasta中提取序列，值得一提的是该软件在提取序列时，可以选择输出的格式，如提取外显子区的序列、CDS序列、翻译成蛋白序列，功能很是贴心。下面来展示一下如何提取。
#提取序列
gffread -g GRCh38.primary_assembly.genome.fa -w test.fa gencode.v34.primary_assembly.annotation.gtf
介绍了几个可以根据bed文件来提取序列的软件，那有些人可能还想知道如何得到bed文件呢？可以根据gtf文件来生成，下面给大家介绍一款用来根据gtf生成bed文件的软件——bedops。这里提醒一下，该软件有很多种安装方式，但推荐大家使用conda安装省事省心，其他方式基本都需要sudo权限。下面来看一下这款软件使用方法。
#安装软件
conda install -c conda-forge -c bioconda bedops
#gtf to bed
gtf2bed < gencode.v34.primary_assembly.annotation.gtf >test.bed
用conda安装好bedops后，激活一下环境就可以使用了，转换格式用的是gtf2bed子软件，值得注意的是该软件的输入输出文件都用重定向的方式，还有一个需要注意的点提醒一下大家，如果你的gtf文件中没有transcript ID这个属性会报错，会出现这样的错误提示“Error: Potentially missing gene or transcript ID from GTF attributes (malformed GTF at line [1]?)” 。此时，可通过下面的命令来解决问题：
#gtf文件没有transcript ID属性可以使用该命令
awk '{ if ($0 ~ "transcript_id") print $0; else print $0" transcript_id \"\";"; }' input.gtf | gtf2bed - > output.bed
最后
今天给大家介绍了四款可以用来从fasta提取序列的软件，外加一个可以将gtf转bed文件的软件，有了这几款软件，基本上提取序列就是很容易的事。这些软件其他的功能也是很不错，大家可以自己去探索吧！emm，今天就分享到这里了。
