- Serrat X, et al. (2014) EMS mutagenesis in mature seed-derived rice calli as a new method for rapidly obtaining TILLING mutant populations. Plant Methods 10(1):5.
背景技术TILLING（靶向诱导的基因组中的局部损伤）是一种反向遗传方法，其将化学诱变与高通量全基因组筛选相结合，用于感兴趣的基因中的点突变检测。然而，这种突变发现方法面临着如何获得具有足够高的突变密度的突变群体的特殊问题。此外，在分析基因型可以开始之前，植物诱变方案需要连续两代（M1，M2）进行突变定位。\ n结果：在此，我们描述了一种基于甲磺酸乙酯（EMS）的水稻新的TILLING方法，成熟种子来源的愈伤组织的诱变和体外再生植物的直接筛选。当植物筛选两个衰老相关基因时，获得高诱变率（即每451Kb中一个突变）。筛选在来自6912突变体群体的2400名个体中进行。确定了15个点突变中的7个意义上的变异突变。\ n \ n结论：这种新策略在时间节省，温室空间和突变植物种群生成期间的工作方面（即超过8个月）具有显着的优势。此外，这种有效的化学诱变方案确保了高诱变率，从而通过诱变体积减少而节省了废物去除成本和所需的诱变剂总量。
背景
水稻（Oryza sativa）是世界上最重要的粮食作物之一。它也是分子生物学和遗传学的典型谷物植物[1]，由于其相对于其他谷物的小基因组大小，整个基因组序列的可用性[2]，易于转化和再生，以及多样性的可用性的突变体。由于水稻基因组的测序于2004年12月完成[2]，功能基因组学被用于确定所有大约50,000个注释基因的功能[3,4]。通过开发各种基因敲除策略已经达到了这一目标[5-7]。
有3种方法可以通过以下方式诱导突变：1）生物制剂如转座子和T-DNA，2）物理试剂，如快中子，紫外线和X射线辐射，或3）化学药剂如N - 甲基-N-亚硝基脲（MNU），1,2：3,4-二环氧丁烷（DEB）或甲磺酸乙酯（EMS）。在这些化合物中，EMS已经成为植物中最有效，最可靠，最强大和最常用的化学诱变剂[8]。 EMS主要诱导产生C / G至T / A转换的CĄVto-T取代[9,10]，而在低频下，EMS通过7-乙基鸟嘌呤生成G / C至C / G或G / C至T / A转换水解或A / T到G / C转换通过3-乙基腺嘌呤配对错误[9-12]。
长期以来，已经将照射和化学诱变用于产生用于育种的突变植物[13,14]。突变的分子筛选在化学诱变剂产生小缺失和点突变得到改善的效率之后得到发展[8,9,15,16]，DNA测序允许鉴定这种点突变。然而，在大量人口中的直接测序是一个缓慢而昂贵的过程。因此，开发了基于物理性质的几种突变检测技术[17-24]，之前酶不匹配检测方法为高效突变种群筛选提供了关键。从曲霉菌[25]，Vigna radiata [26]或Penicillium [27]获得的内切核酸酶是用于检测DNA错配的第一种酶。 Oleykowski等[28]通过使用从电影步骤获得的来自枸杞子的CEL I内切核酸酶改进了该技术，从而为高通量筛选技术铺路。从那时起，酶检测方法与高通量基因分型结合已被改进，用于遗传多态性的有效检测[29-32]。因此，在模型生物体中使用辐射和化学诱变用于功能基因组学研究的兴趣越来越大[33,34]。
化学诱导的突变体种群已经在不同的植物物种中产生[11]，并有效筛选了靶向诱导的基因组（TILLING）高通量筛选方案中的局部损伤[35-37]。这些结合随机化学诱变与靶基因的聚合酶链反应（PCR）扩增，异源双链体形成和一系列等位基因变化的鉴定[38]，通过使用酶学错配切割和电泳。在具有大基因组的植物物种中实现全基因组饱和突变体种群具有挑战性。小型基因组物种如水稻更适合TILLING [30,39,40]。结果，许多水稻突变体群体已经使用这种技术进行了有效的筛选[36,41-43]。
在TILLING化学诱变方法中，将发芽种子在诱变溶液中孵育。直接从诱变处理产生的第一代（M1）不能筛选，因为大多数产生的突变是体细胞的，不能传播到后代[30]。为了解决这个问题，M1突变种群必须生长然后自我受精。 M1性结构中的突变可以产生整个突变的M2后代，从而避免由嵌合引起的任何歧义。所得的M2后代可以筛选出突变。
目前可获得的组织培养方法和诱变技术可显着缩短育种过程，克服一些重大的农艺和环境问题。在大多数情况下，胚胎来源的水稻愈伤组织再生仅由几个细胞产生。因此，可以直接筛选来自突变愈伤组织的再生M1小植株，而无需等待自花授粉的M2群体。已经报道了在未来的胚胎，来自成熟种子的愈伤组织或最近受精的小穗中的单个合子细胞的水稻诱变育种的尝试很少，已报道[44-47]。最近报道了用于突变体表型检测的悬浮培养的水稻细胞的诱变[48]。然而，迄今为止，已经报道了为了获得TILLING的突变种群，在成熟种子来源的水稻愈伤组织中没有化学诱变的研究。
这项工作的目的是实施一个新的TILLING策略，基于来自EMS诱变的胚胎来源的愈伤组织的植物突变种群的生产，然后在再生植物上进行突变筛选。这种突变筛选集中在与衰老有关的两个基因上，因为每年谷物作物的发育过程与繁殖期重叠，并且可能在不利的环境条件下过早诱导时可以降低作物产量。
