引言
在现代分子生物学研究中，准确解析基因表达调控是揭示生命过程与疾病机制的核心。转录组测序（RNA-seq）、实时荧光定量PCR（qPCR）和蛋白质免疫印迹（Western Blot, WB）作为当前最常用的三大技术手段，分别从全转录组、特定mRNA和目标蛋白质三个层面提供关键信息。然而，由于中心法则中转录与翻译并非简单线性关系，mRNA水平的变化往往不能完全反映蛋白质的表达状态；同时，每种技术在灵敏度、通量、定量准确性及适用场景上各有优劣。因此，仅依赖单一方法可能导致结论片面甚至误导。系统比较RNA-seq、qPCR与WB的技术原理、性能特点及其互补性，不仅有助于科研人员根据研究目标合理选择和组合实验策略，更能构建从转录到蛋白的完整证据链，提升研究的严谨性与可信度。
技术介绍
RNA-seq
转录组测序（RNA-seq，RNA sequencing）是指针对某一特定时期、特定条件下转录的所有的信使RNA（message RNA，mRNA）进行高通量测序的技术手段。它利用测序技术对组织或细胞中的 RNA 反转录成 cDNA 文库进行测序。RNA-seq可以测量不同 RNA 的表达量，发现新的转录本，并通过将转录本映射回基因组来确定转录本的位置，了解剪切情况等遗传信息。
qPCR
实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction）简称qPCR，它通过在PCR反应中添加荧光基团达到检测每次PCR循环后产物总量的目的，从而进行定量分析。其中荧光通常分为荧光染料和荧光探针；通过实时荧光定量PCR仪每一次PCR循环结束后均可以实时监测并收集荧光信息；通过荧光强度和CT或者Cq值信息，获取定量的结果。
Western Blotting
蛋白质免疫印迹(protein blotting /Western blotting )用于分离和检测生物样本中的特定蛋白，其基本原理是：通过凝胶电泳按分子量大小分离混合的蛋白质样本，将带有分离蛋白质条带的凝胶在特殊虹吸/电场装置印迹(blot)至固相介质（滤膜）上，使凝胶中已分离的各蛋白条带转移，并以非共价键形式吸附在固相介质的相应位置；而后根据抗原-抗体特异性结合的原理，将针对特定蛋白的特异性抗体作用于滤膜，使目的蛋白与抗体特异性结合，最后利用二抗偶联的酶降解底物生成有色沉淀物或发光产物，或偶联的同位素发生放射自显影，从而定性定量检测目的蛋白。
为何相同基因/蛋白表达趋势在转录组测序/QPCR/WB结果中存在差异
转录组测序是将所有比对上基因的Reads均归入该基因，然后进行基因定量。而qPCR扩增的是转录本上的部分片段（80-200bp），不能代表所有的转录本的定量结果。文章表明，转录组数据与qPCR验证结果一致性在80%左右，两种方法之间有15.1%-19.4%基因在差异表达状态上存在分歧。QPCR定量精度高于转录组测序，遇到二者不一致情况建议以QPCR定量结果为准。
为何对目标基因进行移码突变，但转录组测序未检测到目标基因表达存在差异
移码突变通常由1~2 个碱基的插入或缺失引起，导致阅读框改变、下游氨基酸序列完全错误、提前出现终止密码子。虽然这会严重破坏蛋白功能（常导致无功能截短蛋白），但 mRNA 本身可能仍被正常转录。细胞有一套质量监控系统——NMD（Nonsense-Mediated mRNA Decay），可识别并降解含 PTC 的异常 mRNA。但 NMD 的激活有严格条件，因此，如果移码突变产生的 PTC 位置不符合 NMD 触发条件，mRNA 就不会被降解，RNA-seq 自然检测不到表达量下降，但是WB可以检测到蛋白表达量下降。
为何转录组测序/QPCR结果与WB趋势不符合
转录组测序/QPCR检测的目标是mRNA，其水平反映的是基因的“潜在产能”，而WB检测到的是蛋白质，其水平反映的是细胞的“实际库存与运行状态”。二者不一致是正常的，有文献报道肿瘤中mRNA-蛋白质表达水平斯皮尔曼相关性只有0.4-0.5，这也往往是生物学机制的突破口，目前关于mRNA水平与蛋白质水平存在差异的原因主要有以下几点。
mRNA与蛋白质表达水平差异原因表格
文献分享
标题：Outlier kinase expression by RNA sequencing as targets for precision therapy[3]
通过转录组测序鉴定异常激酶表达作为精准治疗的靶点
期刊：Cancer Discovery
IF：33.3
时间：2013.05
使用技术：RNA-seq、QPCR、WB
结果：
蛋白激酶是癌症治疗中最有效的药物靶点类别，因此鉴定激酶异常已成为癌症基因组学研究的重点。在此，作者分析了一个包含来自25种不同组织类型的482个癌症和良性样本的转录组测序数据集，并基于绝对表达水平和差异表达程度最高这一标准，在单个乳腺癌和胰腺癌样本中定义了独特的“异常激酶”（outlier kinases）。在乳腺癌中常见的异常激酶包括已知治疗靶点如ERBB2和FGFR4，而在胰腺癌中则主要为MET、AKT2和PLK2。通过siRNA敲低和/或药理学抑制实验发现，这些异常激酶在多种细胞系中引发了样本特异性的依赖性。在一部分KRAS依赖性的胰腺癌细胞系中观察到polo样激酶（polo-like kinases）的异常高表达，并使其对泛PLK抑制剂BI 6727的敏感性显著增强。研究结果表明，异常激酶是有效的精准治疗靶点，可通过肿瘤的转录组测序轻松识别。
总结
转录组测序、QPCR和WB分别作用于基因表达的不同层面，其应用方向各有侧重：转录组测序立足于RNA层面，是一种无预设的全局性发现工具，主要用于大规模挖掘表型差异相关的差异表达基因及新RNA亚型，适用于探索性的实验设计；QPCR同样针对RNA层面，但作为一种靶向的绝对/相对定量分析手段，是高灵敏度验证转录组测序结果的金标准；而WB则落脚于蛋白质层面，通过特异性抗体靶向检测目的蛋白的表达丰度及翻译后修饰（如磷酸化、剪切），是连接基因转录与最终生物学功能的核心表型验证技术。因此，科研人员应根据研究目标合理选择并组合使用这三种技术，构建从转录到蛋白的完整证据链，而非孤立地依赖单一方法，从而提升研究的严谨性和科学性。
参考文献
[1] Everaert C, Luypaert M, et al. Benchmarking of RNA-sequencing analysis workflows using whole-transcriptome RT-qPCR expression data [J]. Scientific Reports, 2017,7: 1559.
[2] Ghoshdastider U, Sendoel A. Exploring the pan-cancer landscape of posttranscriptional regulation. Cell Rep. 2023 Oct 31;42(10):113172.
[3] Kothari V, Wei I, Shankar S, et al . Outlier kinase expression by RNA sequencing as targets for precision therapy. Cancer Discov. 2013 Mar;3(3):280-93.
