我也认为长读长测序是 RNA 测序的未来！随着价格的降低和碱基质量的提升，传统的二代RNA-seq会被逐渐取代。
很多物种的转录本非常多样和复杂，绝大多数真核生物基因不符合“一基因一转录本”的模式，这些基因往往存在多种可变剪切（Alternative splicing，AS）形式。目前，基于第二代测序技术的RNA测序（RNA-seq）技术已被广泛用于各种转录组研究。但其测序的序列读长较短（50-300bp），大多只能覆盖转录本的一小部分，导致难以精确重构同一转录本的同源异构体（isoform），因此使得二代RNA测序对于全长转录本的重构是不准确的，片面的。
全长转录组（Full-length transcriptome）测序和分析是基于PacBio和Oxford Nanopore三代测序平台，利用其长读长的特性，建库测序时无需对RNA进行打断，如直接获得包含5’UTR、3’UTR、polyA尾的mRNA全长序列及完整结构信息，从而准确分析有参考基因组物种的可变剪接及融合基因等结构信息，克服无参考基因组物种转录本拼接组装较短、信息不完整的难题 （图1）。
最早PacBio关于全长转录组的产品命名为Iso-Seq, 全称叫做 Isoform-Sequencing, 是对自家开发的转录本测序技术的规范化命名。现在使用最新的试剂盒SMRTbell prep kit 3.0进行测序文库的构建。2023年10月初推出的Kinnex全长RNA建库试剂盒，能将5个转录本串联成一条测序read，充分利用其读长长的优势，提高测序通量，配合Revio系统一起使用，使得对全长转录本进行定量变得更为实际。
Iso-Seq 方法可对整个 cDNA 分子（长达 10 kb 或更长）进行测序，无需进行生物信息学转录本组装，因此可以对批量（bulk）和单细胞转录本组中的新基因和异构体进行表征，并进一步：
- 鉴定可变剪接 (AS) 事件，包括可变起始位点、终止位点、内含子保留和外显子跳跃事件。
- 通过开放阅读框 (ORF) 预测新型同源异构体的功能影响。
- 检测差异表达的同源异构体和同源异构体的转换事件。
- 发现肿瘤样本中的基因融合事件。
- 识别等位基因同源异构体。
一、PacBio Iso-Seq 的实验流程
通过 PacBio SMRTbell prep kit 3.0 构建Iso-Seq测序文库，适用于 PacBio Sequel II 和 Revio 仪器型号 （图2）。
（1）通过带有Oligo-dT的引物富集含有polyA尾的mRNA。
（2）使用 Iso-Seq RT enzyme对mRNA进行反转录。
（3）加入模板转换oligo (Template Switch Oligo, TSO)
（4）通过PCR扩增富集合成的cDNA，此步骤可加入barcode，用于混样。
（5）对全长cDNA进行损伤修复、末端修复、末端加A尾。
（6）连接SMRT哑铃型测序接头，最后结合测序引物，绑定DNA聚合酶，形成完整的SMRT-bell测序文库。
二、Iso-Seq 全长转录组分析流程
1. Iso-seq基础概念 （1）
- ROI：reads of insert
ROI , 全称 reads of insert，可以理解为插入片段，首先看下三代测序文库构建阶段的reads示意图，如图3：
对于上述的文库片段，测序产生的reads 示意图，如图4：
由于是一个环状分子， 随着测序反应的进行，会循环测序；如果把插入片段的正负链都测了一次，就做1个full pass。对于CCS 而言，要求至少有2个full pass , 才能去生成CCS reads。三代测序的特点就是读长很长，可以达到十几kb, 对于短的插入片段而言，CCS这样定义当然没有问题，但是对于全长转录本而言，转录本长度很长，比如转录本长度1kb, 读长3kb, 此时在一个零模波导孔（ZMW）中测序的reads 就不可能达到2个full pass , 也就产生不了CCS reads, 为了解决这个问题，提高reads的利用率，提出了ROI 的概念，ROI 指的就是插入片段，图4测序reads 产生的ROI 如图5：
ROI 不要求满足2个full pass， 相对CCS 而言，更加适合全长转录本的分析。
- Artifacts, 文库构建过程中可能产生的非正常转录本
可以理解为，共有两种来源：
Artificial Concatemer
这种序列是由于文库制备阶段，adapter 序列错误的将两条转录本的序列链接构成了一个环状分子，这个和adapter 浓度有关，通常这种reads 产生的比例很少，小于0.5%， 在后续的分析中，这部分reads 需要去除。
PCR Chimera
在PCR 反应中，由于不完全延伸的产物作为了下次扩增反应的引物，导致出现嵌合体序列，直观上看，就是PCR产物来源于两条或者多条reads。PCR 产生的嵌合体序列，在PCR 反应体系中，这种序列是不可避免的，大约有3%的比例，在后续的分析过程中，可以借助软件去除这部分reads。
- FL Reads
FL , Full-length reads, 全长转录本。从raw data 到 ROI , 在从ROI 去除 artifacts reads 之后，我们就得到了用于后续分析的clean reads。clean reads 就已经是转录本的序列了，我们首先看一下clean reads 当中，哪些是全长转录本；哪些不是全长转录本。
全长转录本的示意图，如图8：
对于全长转录本而言，其ROI reads 中包含5‘ primer 和 3‘ primer; 而且会出现polyA 为结构；（polyA 针对mRNA和部分lncRNA）。
2. Iso-Seq软件
Iso-Seq是PacBio官方开发的一款用PacBio subreads 或 HiFi 数据进行全长转录组分析的一款软件，最终输出高质量转录本的全长序列。截止到2023年6月7号，最新版本为4.0.0。
Github主页：https://github.com/PacificBiosciences/IsoSeq
- 软件安装：isoseq和lima
#使用conda安装isoseq，v4.0.0.
$ conda install -c bioconda isoseq
#lima,用于拆解barcode.
$ conda install -c bioconda lima
- Iso-Seq分析流程
整个Iso-Seq的分析流程如图9：
（1）原始下机数据 subreads.bam 通过CCS软件获得HiFi Reads, hifi.reads.bam。
（2）cDNA两端引物的去除，拆解barcode，调整转录本5' - 3' (polyA)方向。
（3）3' polyA尾和嵌合体（concatemer）序列的去除。
（4）转录本聚类。
（5）Consensus的转录本序列以.fasta格式输出。
- 单个样本官方示例数据演示
（1）示例数据下载
# Download toy S-read dataset
#This is a toy dataset consisting of ~80k segmented reads (S-reads) from a Kinnex full-length RNA library
$ wget https://downloads.pacbcloud.com/public/dataset/IsoSeq_sandbox/human_80k_Sreads.segmented.bam
# Download the Iso-Seq v2 cDNA primers (from Iso-Seq express 2.0 kit)
$ wget https://downloads.pacbcloud.com/public/dataset/Kinnex-full-length-RNA/REF-primers/IsoSeq_v2_primers_12.fasta
Hifi reads两端含有 5' 和 3' 引物序列。
（2）demultiplex，使用lima拆解barcode
$ lima --version
lima 2.9.0
$ lima human_80k_Sreads.segmented.bam IsoSeq_v2_primers_12.fasta human_80k.bam --isoseq --peek-guess
对于iso-seq数据，使用--isoseq加--peek-guess参数来降低假阳性率。可以使用 --biosample-csv input.csv添加样本名称, bio sample name。
Demultplex和 5' - 3' 引物去除后，得到含有polyA尾序列的 Full-Length reads (FL reads)。
（3）refine，使用isoseq refine去除poly(A)和嵌合体（concatemer）序列
- 输入文件为：
<primer--pair>.fl.bam和primers.fasta。 - 输出文件主要为：
<movie>.flnc.bam。
$ isoseq refine human_80K.IsoSeqX_bc10_5p--IsoSeqX_3p.bam IsoSeq_v2_primers_12.fasta human_80K.flnc.bam --require-polya
$ ls human_80K.flnc.*
human_80K.flnc.bam
human_80K.flnc.bam.pbi
human_80K.flnc.consensusreadset.xml
human_80K.flnc.filter_summary.report.json
human_80K.flnc.report.csv
--require-polya ：只有有polyA尾序列才会被认作full length，并且去除polyA序列。
-j，--num-threads: CPU线程数。
--min-polya-length: 最小polyA尾长度，默认值为20。
3' polyA尾和嵌合体（concatemer）序列的去除后得到 Full-Length Non-Concatemer (FLNC) reads。
（4）cluster，转录本聚类
- 输入文件：
<movie>.flnc.bamorflnc.fofn。 - 输出文件：
<prefix>.bam
$ isoseq cluster2 human_80K.flnc.bam human_80K.transcripts.bam
$ ls human_80K.transcripts.*
human_80K.transcripts.bam
human_80K.transcripts.bam.pbi
human_80K.transcripts.cluster_report.csv
输出转录本的同源异构体（isoforms）至少有两个或两个以上的FLNC（full-length non-concatemer）序列支持。如果想包含singletons，可以加入--singletons。
关于满足什么条件isoseq cluster算法会将两条序列聚类为同一个转录本序列（图13）：
（A）5'端差异小于100bp以内。
（B）3'端差异小于30bp以内。
（C）小于10bp以内的gaps，gaps的数量没有上限。
- 混样数据官方示例演示
（1）示例数据下载
# This is a 12-plex regular Iso-Seq (non-Kinex) run on Sequel II system consisting of ~3 million HiFi reads.
# Download HiFi reads from a non-Kinnex (regular Iso-Seq) BAM file
$ wget https://downloads.pacbcloud.com/public/dataset/Kinnex-full-length-RNA/DATA-SQ2-UHRR-Monomer/1-CCS/m64307e_230628_025302.hifi_reads.bam
$ wget https://downloads.pacbcloud.com/public/dataset/Kinnex-full-length-RNA/DATA-SQ2-UHRR-Monomer/1-CCS/m64307e_230628_025302.hifi_reads.bam.pbi
# Download the Iso-Seq v2 cDNA primers (from Iso-Seq express 2.0 kit)
$ wget https://downloads.pacbcloud.com/public/dataset/Kinnex-full-length-RNA/REF-primers/IsoSeq_v2_primers_12.fasta
（2）demultiplex，使用lima拆解barcode
$ lima --version
lima 2.9.0
# Demux and primer removal
$ lima --isoseq --peek-guess m64307e_230628_025302.hifi_reads.bam IsoSeq_v2_primers_12.fasta UHRR.bam
每个barcode对输出一个.bam文件，一共12个.bam文件对应12个样本。
（3）合并拆分样本的文件名
# Combine inputs
$ ls UHRR.IsoSeqX*bam > all.fofn
$ cat all.fofn
UHRR.IsoSeqX_bc01_5p--IsoSeqX_3p.bam
UHRR.IsoSeqX_bc02_5p--IsoSeqX_3p.bam
UHRR.IsoSeqX_bc03_5p--IsoSeqX_3p.bam
UHRR.IsoSeqX_bc04_5p--IsoSeqX_3p.bam
UHRR.IsoSeqX_bc05_5p--IsoSeqX_3p.bam
UHRR.IsoSeqX_bc06_5p--IsoSeqX_3p.bam
UHRR.IsoSeqX_bc07_5p--IsoSeqX_3p.bam
UHRR.IsoSeqX_bc08_5p--IsoSeqX_3p.bam
UHRR.IsoSeqX_bc09_5p--IsoSeqX_3p.bam
UHRR.IsoSeqX_bc10_5p--IsoSeqX_3p.bam
UHRR.IsoSeqX_bc11_5p--IsoSeqX_3p.bam
UHRR.IsoSeqX_bc12_5p--IsoSeqX_3p.bam
fofn: "files-of-file-names"的缩写。
（4）refine，使用isoseq refine去除poly(A)和嵌合体（concatemer）序列
# Remove poly(A) tails and concatemer
$ isoseq refine all.fofn IsoSeq_v2_primers_12.fasta UHRR.flnc.bam --require-polya
$ ls UHRR.flnc.*
UHRR.flnc.bam
UHRR.flnc.bam.pbi
UHRR.flnc.consensusreadset.xml
UHRR.flnc.filter_summary.report.json
UHRR.flnc.report.csv
（5）cluster，转录本聚类
$ isoseq cluster2 UHRR.flnc.bam UHRR.transcripts.bam
（6）Polish （可选择）
$ isoseq cluster flnc.fofn clustered.bam --verbose --use-qvs
这里使用isoseq cluster，而不是isoseq cluster2, cluster相比于cluster2比较耗时。Polish会略微提升数据质量，不是必须步骤。 运行完成以后获得以下文件：
<prefix>.bam-
<prefix>.hq.fasta.gzwith predicted accuracy ≥ 0.99 -
<prefix>.lq.fasta.gzwith predicted accuracy < 0.99 <prefix>.bam.pbi<prefix>.transcriptset.xml
综上所展示，iso-seq分析流程及每一步输出文件总览，如图16。
