文献信息
【文章标题】Single‐Cell Transcriptome Analysis Uncovers Intratumoral Heterogeneity and Underlying Mechanisms for Drug Resistance in Hepatobiliary Tumor Organoids
【发表杂志】Adv Sci (Weinh).（IF：15.1）
【发表时间】2021年3月
【应用技术】类器官、10x Genomics scRNA-seq
【关 键 词】肝胆肿瘤类器官（Hepatobiliary Tumor Organoids）、肿瘤耐药性（Drug Resistance）、单细胞转录组测序（Single‐cell RNA Sequencing）
闪光点
1、 类器官与单细胞测序技术联合应用，文章使用单细胞测序从细胞、基因和功能层面来表征患者来源的肝胆肿瘤类器官，揭示与化疗耐药有关的肿瘤干细胞在类器官中的生物学和转录组的异质性。
2、 不同于常规分析中样本混合后再对细胞进行分群，本文中针对每个样本都分析了其中的差异细胞群，从而更好地了解肿瘤内异质性及其对细胞恶性影响的潜在机制。
3、 进化轨迹分析与拟时分析结合，确定了肿瘤内异质性和独特的进化轨迹。
方法与结论
样本：4例肝癌、2例肝内胆管癌和1例胆囊肿瘤患者肿瘤组织（未进行术前治疗）培养类器官
亮点解析
在Web of Science 数据库中检索“organoid”, 从 2009年Hans Clevers 成功构建小肠类器官起，类器官相关文章从最初的23 篇跃升至今的7019 篇，类器官技术相关科研文献逐年上升。从文献发表的国家/地区看，中国发表文献 1095 篇，位居第二位，成为类器官领域的重要科研力量。
类器官（Organoids）定义为：“器官特异性细胞的集合，这些细胞从干细胞或器官祖细胞发育而来，并能以与体内相似的方式经细胞分序和空间限制性的系别分化而实现自我组建”。需具备以下特征：1、包含模拟器官中一个以上的细胞类型；2、表现出模拟器官特有的一些功能；3、细胞组织方式与模拟器官相似[1]。
目前类器官可分为两类：组织来源类器官（图3a）和多能干细胞(iPSC)来源类器官（图3d）[2]。组织来源的类器官需要将原生组织分解成含有干细胞的功能性亚组织单元，再进一步消化成单个细胞并进行流式细胞分选以富集干细胞；源自胚胎干细胞(ESC) 和诱导多功能干细胞的类器官向所需的胚系进行定向分化；富集的干细胞/定向分化的细胞需聚集产生浮动的球状体，随后被嵌入细胞外基质 (ECM) 开始类器官培养。
介导类器官形成的信号通路需要与体内器官发育与稳态维持的信号通路相同，所以在培养的同时培养基中需要添加生长因子和小分子等（图3f），以激活或者抑制参与类器官形成所依赖的特定信号通路，从而实现干细胞定向分化，并自组织成功能性 3D 结构的目的。
时至今日，类器官应用日趋广泛，在科研应用领域主要集中于疾病模型研究等方向，那么它与传统细胞培养及动物模型对比，秀在何处？
1、与传统的体外培养不同，类器官在组成和结构上与原代组织相似：包含了少量基因组稳定、自我更新的干细胞，这些子代的细胞谱系与活组织的主要细胞谱系相似；
2、原发组织来源的类器官缺乏间充质/间质，为研究感兴趣的组织类型提供了一种简化的途径，而不受局部微环境的干扰；
3、类器官是传统 2D 培养和体内小鼠模型之间的重要桥梁，因为它们比单层培养模型更具有生理相关性，而且比体内模型更易于操纵生态位成分、信号通路和基因组编辑。
单细胞测序技术也是近年来受到青睐的明星技术，在 2018 年 Science 公布的十大科学突破中 ，单细胞技术位列十大突破之首。2019 年，单细胞多组学技术被 Nature Methods 评为年度技术。高通量单细胞测序技术通过对每个细胞遗传物质的分析，在单细胞分辨率下研究细胞的发育、分化，成为探索组织发育、肿瘤异质性等生物问题的重要方法。
最近，类器官已应用于模拟各种癌症，包括前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌和胃肠道癌，并有助于对肿瘤内的表型和分子异质性的描述。类器官不仅可以保留原始肿瘤的基因变化和基因表达，而且在体内具有转移潜力，这些特性都使类器官能全面地反映原始肿瘤的特征，包括肿瘤内异质性。为了探索肝胆肿瘤的细胞多样性及耐药性机制，研究团队建立了患者来源的肝胆肿瘤类器官，并进行了scRNA-seq。但是与常规分析不同的是，文章将所有样本的单细胞进行降维聚类后发现每个样本都有其独特的细胞亚群，那这时候怎么办呢？
本文给我们提供了一个非常好的思路，就是我们可以单独分析每个样本中的差异细胞群的转录情况，焦点从常规细胞分类转移至样本间基因转录异质性。使用相同的PCA比率和分辨率，将7个类器官样本分成不同数量的细胞亚群，之后基于群体细胞的表达数据，筛选出10个共表达基因（图7B），分析这些基因在不同亚群中表达情况，从而更好地了解肿瘤内异质性及其对细胞恶性影响的潜在机制。
虽说本文跳过了常规细胞分类分析，但是拟时分析是不会缺席哒。下面我们一起来看看这篇文章是怎样用拟时分析玩出花样的（图8）。由于前面单独分析了每个样本中差异细胞群的转录情况，所以我们通过样本中基因集表达情况绘制各样本对应的细胞分化轨迹图，本文将拟时分析与进化轨迹分析联合起来，将各类器官样本进行了分类：增殖优势类器官、代谢优势类器官、其他类型类器官。从而直观获得每个类器官样本中细胞分化发育轨迹，对比分析不同类型类器官中优势细胞群。
参考文献
[1] Lancaster, Madeline A, and Juergen A Knoblich. “Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.” Science (New York, N.Y.) vol. 345,6194 (2014): 1247125. doi:10.1126/science.1247125 IF: 56.9 Q1 B1 IF: 56.9 Q1 B1 IF: 56.9 Q1
[2] Fatehullah, Aliya et al. “Organoids as an in vitro model of human development and disease.” Nature cell biology vol. 18,3 (2016): 246-54. doi:10.1038/ncb3312 IF: 21.3 Q1 B1 IF: 21.3 Q1
[3] Li, Mo, and Juan C Izpisua Belmonte. “Organoids - Preclinical Models of Human Disease.” The New England journal of medicine vol. 380,6 (2019): 569-579. doi:10.1056/NEJMra1806175 IF: 158.5 Q1
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