3.噬菌体疗法
早在1921年，Bruynoghe和Maisin就率先用噬菌体制剂治疗葡萄球菌引起的皮肤感染。此后噬菌体广泛应用于耳喉科、口腔科、眼科、皮肤科及肺部疾病等的治疗。但在20世纪40年代以后，由于抗生素的逐渐普及使用，噬菌体疗法日渐淡出。近年来，随着抗生素耐药问题的日益严重，高水平耐药的"超级细菌"不断出现，而新型抗生素的研发又远远落后，因此，噬菌体治疗重新回到了临床医生的视野中，成为新近研究的热点问题之一。
噬菌体是感染细菌、真菌、藻类 、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，噬菌体广泛存在于自然环境，土壤、海洋、污水中，数量庞大、种类繁多，是地球上最丰富和最普遍的生物，自然界中噬菌体的数量达到1031，是细菌数量的10倍【https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/pmc/articles/PMC3109452】。一项研究显示，人类肠道含有超过 54,000 种噬菌体，其中 90% 都是科学家未知的【 https://www.nature.com/articles/s41564-021-00928-6】。噬菌体疗法是指将噬菌体制作成微生物菌剂用以治疗病原菌的感染的一种治疗方法，由于噬菌体较强的特异性，在机体内只捕食某种特定细菌，随着细菌数量的减少，噬菌体被机体的免疫系统作为外源物质而吞噬分解。
目前有关于噬菌体在临床上成功治疗超级细菌的案例已有很多。2017年Schooley等[Schooley R T, Biswas B, Gill J J, et al. Development and use of personalized bacteriophage-based therapeutic cocktails to treat a patient with a disseminated resistant Acinetobacter baumannii infection[J]. Antimicrob Agents Ch, 2017, 61(10): e00954-17.]报道了一起噬菌体疗法，成功治愈坏死性胰腺炎和多重耐药鲍曼不动杆菌感染患者。治疗过程中将噬菌体鸡尾酒与抗生素联合应用，使患者病情得到显著改善，最终消除高度耐药的鲍曼不动杆菌感染。2019年Nir-Paz等[Nir-Paz R, Gelman D, Khouri A, et al. Successful treatment of antibiotic-resistant, poly-microbial bone infection with bacteriophages and antibiotics combination[J]. Clin Infect Dis, 2019, 69(11): 2015-2018.]报道一起多重耐药细菌混合感染的细菌性骨髓炎治疗，医院决定使用噬菌体疗法，将噬菌体与抗生素联合应用。仅在短短几天内，患者伤口开始恢复，疼痛消除，且治疗期间未监测到噬菌体疗法的不良反应，噬菌体与抗生素的联合应用比单独使用任何一种治疗方式更有效。2021年， Anaïs Eskenazi研究团队用噬菌体疗法与抗生素联用能显著改善患有骨折相关性泛耐药肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）感染的一名30岁患者的身体状况。【Combination of pre-adapted bacteriophage therapy and antibiotics for treatment of fracture-related infection due to pan drug-resistant Klebsiella pneumoniae】2022年， Jessica Little研究团队通过结合抗生素和手术，噬菌体疗法被证明能有效治疗免疫功能低下患者的多重耐药菌龟分枝杆菌（Mycobacterium chelonae）感染，这是首次报道噬菌体疗法成功治疗龟分枝杆菌感染，并描述了观察到的临床疗效。【Bacteriophage treatment of disseminated cutaneous Mycobacterium chelonae infection】。
噬菌体疗法是近年来备受人们关注的一种对抗耐药菌的方法[F1.4]，前已经报道了多起抗生素治疗失败而通过噬菌体疗法成功治愈的病例[F1.5, F1.6].噬菌体疗法是通过噬菌体的侵入导致细菌细胞的裂解，破坏细菌的新陈代谢，并导致细菌自毁治疗手段[F1.7] 。根据噬菌体只能侵染一种病原菌的特点，科研者利用生物工程技术对噬菌体改造，建立宿主域更广泛的噬菌体文库，并能够有效抑制噬菌体感染下的细菌耐药性产生。而这些工程化的噬菌体通常不会引起细菌的抗药性(F1.8)。
3.1 噬菌体侵染微生物的机制
噬菌体必须在活菌内寄生，有严格的宿主特异性，其取决于噬菌体吸附器官和受体菌表面受体的分子结构及其互补性。它的独特之处在于通过寄生在宿主菌体内复制增殖，产生许多子代噬菌体，并最终“吃掉”细菌。整个过程可以分为以下五个步骤【Taylor, N., Prokhorov, N., Guerrero-Ferreira, R. et al. Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction. Nature 533, 346–352 (2016). https://doi.org/10.1038/nature17971】：（1） 吸附噬菌体吸附蛋白与宿主表面受体蛋白发生特异性结合的过程。不同噬菌体其细胞受体各不相同，有的在细胞壁上，有的则在荚膜上、鞭毛上或性菌毛上，例如T3、T4和T7等噬菌体，其细胞受体是脂多糖，T2和T6噬菌体的受体是脂蛋白，枯草杆菌噬菌体SP-50的受体是磷酸壁；（2）侵入：当一个噬菌体找到它的宿主时，噬菌体会用它的尾丝像针管一样穿破细菌的表面，再将它的遗传信息通过它的尾巴注入进细菌中，衣壳则留在胞外【Kostyuchenko, V. A. et al. The tail structure of bacteriophage T4 and its mechanism of contraction. Nature Struct. Mol. Biol . 12, 810–813 (2005)】；（3）噬菌体大分子的合成：组成噬菌体的核酸和蛋白质，是以进入宿主的噬菌体核酸为模板，利用细菌的遗传物质原料来进行物质的合成；（4）装配：噬菌体的装配受到遗传信息的调控，按照一定的程序在宿主内完成各部分的组装，县城一个具有完整功能结构的子代噬菌体；（5）释放：大多数噬菌体裂解细胞的方式被释放至胞外，在这个过程中溶菌酶水解细胞壁，脂肪酶水解细胞膜，使细胞裂解，子代噬菌体被释放。新的噬菌体四处散开，寻找新的宿主并吸附，重复上述的循环，最终使目标感染细菌被消灭。
3.2 噬菌体的产物内溶素
噬菌体的内溶素是其感染细菌后在裂解后期产生的一种裂解酶【Bacteriophage lytic enzymes: novel anti-infectives】 [Briers, Y.; Walmagh, M.; Van Puyenbroeck, V.; Cornelissen, A.; Cenens, W.; Aertsen, A.; Oliveira, H.; Azeredo, J.; Verween, G.; Pirnay, J. Engineered endolysin-based “Artilysins” to combat multidrug-resistant gram-negative pathogens. MBio 2014, 5, e01379-14.].， 主要作用是通过降解细菌的肽聚糖来协助新的噬菌体从感染的细胞中释放【Vollmer, W.; Bertsche, U. Murein (peptidoglycan) structure, architecture and biosynthesis in Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 2008, 1778, 1714–1734】。Phage endolysins are analogous to bacterial lysins in structure and function, which are closely linked to the small family of mammalian peptidoglycan recognition proteins [Low, L.Y.; Yang, C.; Perego, M.; Osterman, A.; Liddington, R. Role of net charge on catalytic domain and influence of cell wall binding domain on bactericidal activity, specificity, and host range of phage lysins. J. Biol. Chem. 2011, 286, 34391–34403.]. The endolysin architectures are different between Gram-positive and Gram-negative phages. As for Gram-positive phages, most endolysins are composed of two domains, an N-terminal enzymatic activity domain (EAD) and a C-terminal cell wall binding domain (CBD), which are connected by a short flexible linker [Oliveira, H.; Melo, L.D.; Santos, S.B.; Nóbrega, F.L.; Ferreira, E.C.; Cerca, N.; Azeredo, J.; Kluskens, L.D. Molecular aspects and comparative genomics of bacteriophage endolysins. J. Virol. 2013, 87, 4558–4570.].EAD有助于肽聚糖中不同键的断裂，而CBD识别并特异性结合细菌细胞壁受体[Oliveira, H.; Azeredo, J.; Lavigne, R.; Kluskens, L.D. Bacteriophage endolysins as a response to emerging foodborne pathogens. Trends Food Sci. Technol. 2012, 28, 103–115.]。催化域含有 5种主要类型的酶活性：Ｎ-乙酰胞壁酶�转糖苷酶�内ｂ-Ｎ-乙酰氨基葡糖苷酶�内肽酶或者 Ｎ-乙酰胞壁酰-Ｌ-丙氨酸酰胺酶。具有前 3种酶活性的内溶素�作用部位在肽聚糖的糖基上�而内肽酶和酰胺酶作用部位不同�分别作用于肽键和聚糖与肽连接的酰胺键。【ＦｉｓｃｈｅｔｔｉＶＡ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｌｙｓｉｎｓａｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ［Ｊ］．ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ�2008�11 （5）：393－400】
内溶素被认为是一种非常具有潜力的抗生素，与通常抗生素相比，具有许多特有的优势，比如对宿主的强特异性、细菌产生耐药性的风险更低、能在生物膜和荚膜表面发挥生物学作用等。【Yang, H.; Linden, S.B.; Wang, J.; Yu, J.; Nelson, D.C.; Wei, H. A chimeolysin with extended-spectrum streptococcal host range found by an induced lysis-based rapid screening method. Sci. Rep. 2015, 5, 1–12. [CrossRef] [PubMed] 19. Domenech, M.; García, E.; Moscoso, M. In vitro destruction of Streptococcus pneumoniae biofilms with bacterial and phage peptidoglycan hydrolases. Antimicrob. Agents Chemother. 2011, 55, 4144–4148. [CrossRef] [PubMed] 20. Schuch, R.; Nelson, D.; Fischetti, V.A. A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis. Nature 2002, 418, 884–889.】实际上，来自微生物的分子（内溶素）比微生物本身（噬菌体）更适用于治疗，因为前者更具优势，包括在监管方面。此外，这些内溶素还可能会被进一步改造，以提高它们在根除不同微生物方面的特异性或有效性。
内溶素种类多样，大多数内溶素具有物种特异性，大量的研究表明内溶素在生物膜上具有重要的作用。For example, the staphylococcal endolysins SAP-2 and Phi11 eliminate biofilms formed on polystyrene surfaces [124,125], while the endolysin LysH5 has staphylococcal biofilm-removal properties, with no resistant cells after treatment [126]. PlyGRCS, a staphylococcal endolysin with a single EAD that destroys MRSA, disturbs biofilms as well [128]. The endolysin Lys84 with two catalytic domains (CHAP and amidase_2) and a CBD (SH3b) effectively removed around 90 % of the biofilms of S. aureus, and CHAP and Amidase_2 domains remained 61.20 and 59.46 % of lytic activity as well as 84.31 and 70.11 % of the anti-biofilm activity of Lys84, respectively [63]. CHAPk, a truncated LysK endolysin with only the N-terminal endopeptidase domain, can eliminate S. aureus biofilms on surfaces [129]. In other research, the amidase domain of the L. monocytogenes phage vB_LmoS_293 endolysin prevented biofilm formation on abiotic surfaces [94], while the Salmonella endolysin Lys68 in combination with malic or citric acid decreased biofilms [134]. The endolysins used for the biofilms formed by P. aeruginosa also have been developed. The endolysin LysPA26 resulted in a 1~2 log reduction in biofilm-associated P. aeruginosa on a polystyrene plate within 2 h without the use of outer membrane permeabilizers [135]. These findings indicate that endolysins are promising anti-biofilm agents.。通过将内溶素融合到其他结构域，可以将内溶素穿过革兰氏阴性外膜或传递到真核细胞中以靶向细胞内细菌。2019年，Micreos公司宣布Staphefekt™SA.100是首个批准用于人体的细胞内溶素，它具有极强的杀菌能力，可以在抗药性金黄葡萄球菌等耐药细菌中，于细菌外层进行撕破，从而进入细胞进行杀菌工作。Micreos's first pharmaceutical endolysin, XZ.700, is currently in a Phase I/IIA clinical trial for global registration for atopic dermatitis. 【Micreos Raises €30 Million for Endolysin Technology Set to Replace Antibiotics Retrieved on March 29, 2019 from Micreos官网】（Home - Micreos.com）
3.3 噬菌体与抗生素联用疗法（bacteriophage therapy，BT）
噬菌体和抗生素联合应用时，以药物外排泵(efflux pumps)为受体的噬菌体迫使耐药细菌的外排泵突变以产生噬菌体抗性，导致对抗生素的敏感性增加[44-45]，Benjamin K Chan等[44]发现，噬菌体能够利用MexAB和MexXY多药外排系统的外膜蛋白OprM作为受体结合位点，对多种药物耐受的铜绿假单胞菌为阻止噬菌体入侵，改变其外排泵蛋白结构，导致其对几种抗生素的敏感性增加。大肠埃希菌的TolC蛋白是细菌外排系统的一部分，也是噬菌体进入细胞的受体，TolC改变的抗性突变体对噬菌体耐受，但对新霉素高度敏感[47]。这些现象都与噬菌体突变耐药细菌的药物外排泵有关。
细菌荚膜对噬菌体的吸附十分重要，细菌极容易通过丢失荚膜来改变噬菌体吸附效率，导致抗生素对耐药细菌重新敏感[10,48-49]。Schooley团队发现多重耐药鲍曼不动杆菌可丢失荚膜对噬菌体产生抗性，但这使得抗生素更容易穿透其外膜[10]。Altamirano等[48]表明对噬菌体产生抗性的鲍曼不动杆菌合成荚膜的基因缺失，破坏噬菌体吸附，但重新对抗生素敏感。
生物膜的形成有助于细菌逃避宿主的免疫系统并增加其抗生素耐受性，与多种细菌的严重感染密切相关[6]。成熟的生物膜阻止抗生素渗透到膜内部，但噬菌体可以在生物膜中形成通道，使抗生素通过该路径扩散至生物膜内部并达到较高浓度[51]。部分噬菌体为更加有效的穿透EPS层，会在尾部或尾纤维上携带一种EPS多糖解聚酶[62]。这类酶能降解生物膜，与抗生素产生协同作用，有些还能杀灭生物膜内细菌[38,63-65]。
3.4 噬菌体疗法的优势与挑战
2019 年和 2021 年数据的比较结果表明，噬菌体药物开发领域出现了一定的增长和发展，因为越来越多的公司参与到了将噬菌体作为药物产品的科技挑战中。目前有30家不同的公司从事噬菌体和/或内溶素的药物开发，比 2019 年增加了 60%。这些公司参与的研发项目数量也在短短 2 年内大幅增加（目前正在进行的项目为 100 个，而 2019 年仅为 52 个）。Kutter 等报道噬菌体疗法治疗人类疾病具有极大的潜力，指出通过实践和试验等方法最终使噬菌体疗法商业化是避免此疗法被忽视的关键。随着越来越多力量加入到噬菌体研究领域，噬菌体疗法相关的技术和制度正在逐渐完善，跟传统化学抗生素相比，噬菌体疗法具有许多不可比拟的优势，但同时也面临着许多问题。
与传统化学抗生素药物相比，噬菌体作为天然捕食者，具有许多独有的优势。第一，噬菌体宿主特异强，特异性地针对一种细菌，能靶向特异致病的细菌，而对体内正常菌群没有影响，在肠道致病菌治疗中十分重要;。当然，2019年，Timothy K. Lu教授通过生物工程方法改造噬菌体扩大噬菌体的宿主范围【Engineering Phage Host-Range and Suppressing Bacterial Resistance through Phage Tail Fiber Mutagenesis】；第二，获取目标噬菌体的周期更短。获得新的噬菌体只需要几周的时间，而获得新的抗生素却需要很多年。当细菌对噬菌体产生耐药性时，噬菌体也会与之一起发生自然变化； 第三， 噬菌体的局部使用具有特殊的优势，因为它们穿透力更强，能够到达所有细菌感染的部位，而抗生素的浓度会在感染表面以下迅速降低； 因此噬菌体不会出现抗生素的继发性耐药性问题，随着耐药性细菌产生的问题越来越多以及新抗生素研发的缺乏，使用噬菌体将会是应对细菌感染的有效方法。
噬菌体治疗作为一种新型的治疗方式，在很多方面还存在着许多不确定性。第一，噬菌体的分离、纯化与保存有一定难度；第二：噬菌体治疗具有较强的个性化，不同患者的不同感染菌株所对应的噬菌体是不同的，因此需要建立一个完善的噬菌体库以便于治疗筛选；第三：目前噬菌体治疗所需噬菌体的使用数量、给药方式和治疗周期都没有建立统一的标准；第四：宿主细菌不仅能够通过表面受体突变产生噬菌体感染抵抗性，还能够通过其它机制，如顿挫感染（abortive infection）系统、CRISPR系统以及胞外多糖包裹以阻止受体结合的方式来对抗噬菌体的侵染；第五，噬菌体作为一种生物药品，在体内的生物学行为不可控，其安全性无法得到有效管控，比如：噬菌体存在变异后改变宿主的坑能行、编程杀伤正常菌群的毒株、介导耐药基因或/和毒力基因进入正常细菌的可能性；因此，在这些问题没有得到解决之前，噬菌体疗法很难成熟的进入临床治疗方案中。
