Cell Res | 肿瘤抗原特异性T细胞增强个性化TCR-T细胞治疗和预测免疫治疗反应

原创 huacishu 图灵基因 

收录于话题#前沿分子生物学机制

撰文：huacishu

IF=20.808

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亮点：

1、利用scRNA-seq、TCR-seq和体外新抗原刺激，作者揭示了肿瘤中Tas细胞的特征。有几种标记物被鉴定出能特异性区分肿瘤中的CD4+和CD8+Tas细胞；

2、进一步研究表明，用Tas-TCR工程的T细胞对自体PDX肿瘤具有显著的治疗效果。经鉴定的表面生物标记物能够通过FACS分选从肿瘤中分离Tas细胞。

中山大学周鹏辉教授课题组在国际知名期刊Cell Res在线发表题为“Defined tumor antigen-specific T cells potentiate personalized TCR-T cell therapy and prediction of immunotherapy response”的论文。针对肿瘤特异性抗原（TSA）的个性化免疫治疗可以在不损害正常组织的情况下产生高效、安全的抗肿瘤免疫反应。尽管新抗原疫苗已在临床试验中显示出治疗效果，但从肿瘤突变中准确预测新抗原仍然具有挑战性。宿主抗肿瘤免疫反应选择并激活识别肿瘤抗原的T细胞。因此，从患者体内自然产生的肿瘤抗原特异性T（Tas）细胞中获得T细胞受体（TCR）的T细胞将靶向其肿瘤中的TSA。为了建立这种个性化的TCR-T细胞疗法，作者通过单细胞mRNA测序（scRNA-seq）、TCR测序（TCR-seq）和体外新抗原刺激对肿瘤及其邻近组织中的T细胞进行了综合表征。与组织间循环的旁观者T细胞相比，Tas细胞具有肿瘤富集、肿瘤特异性克隆扩增和新抗原特异性的特点。发现CXCL13是CD4+和CD8+Tas细胞的独特标记物。重要的是，从Tas细胞表达TCR的TCR-T细胞对自体患者源性异种移植（PDX）肿瘤显示出显著的治疗效果。通过CXCL13表达测定的肿瘤内Tas细胞水平准确预测了对免疫检查点阻断的反应，表明Tas细胞在抗肿瘤免疫中起着关键作用。进一步将CD200和ENTPD1分别鉴定为CD4+和CD8+Tas细胞的表面标记物，这使得通过荧光激活细胞分选仪（FACS）从肿瘤中分离Tas细胞成为可能。总的来说，作者的结果表明，用Tas-TCR基因工程的TCR-T细胞是一种有前途的个体化免疫治疗剂，肿瘤内Tas细胞水平决定了免疫治疗的反应。

作者建立了一个体外肿瘤抗原刺激系统，以研究测序T细胞TCR的抗原特异性（图1a）。简而言之，构建TCR序列并将其从外周血单个核细胞（PBMC）导入T细胞，以建立TCR-T细胞。通过肿瘤和肿瘤周围组织的全外显子测序（WES）和大量RNA测序（RNA-seq）鉴定来自肿瘤突变的有效新抗原表位。以自体B细胞经EB病毒（EBV）感染转化的B淋巴细胞样细胞作为抗原呈递细胞（APC）。体外肿瘤抗原刺激是通过将TCR-T细胞与由肿瘤特异性突变序列组成的串联微基因转导的APC共培养来实现的。通过产生γ干扰素（IFNγ）来评估受试TCR的反应。同时，将测序患者的肿瘤移植到免疫缺陷的小鼠中，以建立用于TCR-T细胞治疗实验的PDX模型。对扩增的CD4+和CD8+T细胞进行了单独的聚类分析，并通过特定的基因表达特征识别了10个CD4和9个CD8簇（图1b）。T细胞亚型的经典标记物表明CD4+和CD8+T细胞以及CD4+调节性T细胞（Treg）中存在传统的效应、记忆、衰竭簇（图1c）。在CD4+和CD8+T细胞中发现了两个具有活跃的有丝分裂的簇（CD4_C10_MKI67和CD8_C9_MKI67），其特征是MKI67、TK1和STMN1的高表达。在以前的研究中也有类似的聚类报告。为了找到肿瘤中富集的T细胞群，检查了每个簇的组织分布（图1d，f）。与之前的报道一致，血液和组织中的T细胞被分成不同的簇。两个CD4（CD4_C1_LEF1和CD4_C2_PRF1）和两个CD8簇（CD8_C1_LTB和CD8_C2_CX3CR1）主要包含血液中的T细胞，而其他簇几乎完全位于其他三个组织中。肿瘤周围和正常组织共享记忆和效应簇，但在肿瘤中观察较少，除了GZMK高表达的记忆簇（CD4_C3_GZMK和CD8_C3_GZMK）在所有三种组织中扩散（图1d，f）。衰竭的簇（CD4_C9_CXCL13和CD8_C8_CXCL13）、CD4+Tregs（CD4_C8_FOXP3）和有丝分裂活跃的簇（CD4_C9_MKI67和CD8_C9_MKI67）在肿瘤中富集。CD4_C9_MKI67簇也出现在正常组织中（图1d，f）。每个簇的组织分布也通过比较观察到的和预期的每个簇的细胞数得到证实（图1e，g）。有趣的是，衰竭标记物（HAVCR2、CTLA4、TIGIT、LAG3和TOX）的高表达并不局限于两个衰竭簇；CD4+Tregs和具有活跃有丝分裂的CD8簇显示出这些基因的相似表达水平（图1c）。在有丝分裂活跃的CD4簇中也观察到中等水平的耗竭基因。这些发现揭示了肿瘤富集簇中基因表达的耗尽特征，表明这些簇中的T细胞经历了抗原刺激。

作者比较了肿瘤TCR在肿瘤及其邻近组织中的分布。观察到组织共有的和肿瘤特异性TCR（图2a），表明循环和局部扩张共同促进了肿瘤中的T细胞组成。总的来说，CD8+T细胞在肿瘤中的克隆频率高于CD4+T细胞（图2a），表明这些患者的肿瘤抗原主要由MHC I类分子呈现。为了确定哪些簇保留了在肿瘤中特异性扩增的T细胞克隆，作者选择了每个簇中肿瘤T细胞的前10个TCR，并比较了它们在肿瘤及其邻近组织中的分布。这四个血液特异性簇没有被分析，因为它们含有极少的肿瘤T细胞。在富含肿瘤的簇（CD4+T细胞中的C9、C10和CD8+T细胞中的C8、C9）中观察到肿瘤特异性TCR扩增，但在其他簇中未观察到（图2b）。这些结果表明，肿瘤富集簇中的T细胞被肿瘤抗原扩增。如图2c所示，具有肿瘤特异性TCR扩增的簇（CD4+T细胞中的C9、C10和CD8+T细胞中的C8、C9）的比例与TMB显著正相关。这些数据支持TCR在肿瘤富集簇中的扩增主要由肿瘤突变衍生的新抗原的刺激介导。

为了确定含有肿瘤中特异性扩增的TCR的T细胞的生物标记物，将具有肿瘤特异性TCR的T细胞的基因表达与肿瘤CD4+或CD8+T细胞中具有组织共享TCR的T细胞进行比较。CD4+Treg细胞也与组织共有TCR的CD4+T细胞进行比较。在这些T细胞群中发现了许多差异表达基因（图3a）。有趣的是，CXCL13在具有肿瘤特异性TCR的CD4+和CD8+T细胞中特异性表达（图3b）。作者进一步检查了每个T细胞簇中CXCL13的表达，发现肿瘤富集簇（CD4+T细胞中的C9、C10和CD8+T细胞中的C8、C9）表达高水平的CXCL13（图3c）。然后，在CXCL13+T细胞中观察到肿瘤特异性TCR扩增（图3d）。作者还比较了CD4+CXCL13+、CD4+CXCL13−中四种类型TCR（1α1β、1α2β、2α1β和2α2β）的频率, CD8+CXCL13+和CD8+CXCL13−对10名测序患者的T细胞进行检测，发现CXCL13+和CXCL13−之间的频率在统计学上并不显著。此外，在10例测序的非小细胞肺癌（NSCLC）患者中，CXCL13+细胞在总肿瘤T细胞中的百分比与TMB呈正相关（图3e）。对来自癌症基因组图谱（TCGA）数据库的肿瘤RNA-seq数据的分析还显示，CXCL13和TMB在多种癌症类型中的中位表达之间存在显著相关性（图3f）。这些数据表明，CXCL13是肿瘤中特异性扩增的T细胞的独特标记物。

然后，将每个TCR-T细胞系分别与串联基因导入的混合淋巴母细胞系(LCL)共同培养。TCR-T细胞与未经诱导的LCL共培养作为对照。通过细胞内染色测定TCR-T细胞中IFNγ的产生，以评估对抗原刺激的反应（图4a）。TCR-T细胞产生的IFNγ至少是对照组的3倍，被确定为阳性反应。在P4患者中，一个CD4+和四个CD8+肿瘤特异性TCR对肿瘤抗原刺激呈阳性反应，但在肿瘤共有的TCR中未检测到阳性反应（图4b）。在P5患者中，一个CD4+和所有CD8+肿瘤特异性TCR对肿瘤抗原刺激呈阳性反应，但所有肿瘤共有的TCR均未显示阳性反应（图4c）。这些数据提供了直接证据，证明TCR在肿瘤中特异性扩增并识别肿瘤抗原。来自P4患者的一个CD8+肿瘤特异性TCR和两名患者中的大多数CD4+肿瘤特异性TCR对肿瘤抗原刺激呈阴性，这可能是因为他们识别了未包含在分析中的TAA或肿瘤突变。CD4+肿瘤特异性TCR的低频率也表明相应的肿瘤抗原在肿瘤中的表达水平相对较低。综合这些数据，得出结论，肿瘤中的CXCL13+T细胞是Tas细胞。接下来，使用来自P4或P5患者的肿瘤样本在NSG小鼠中建立PDX肿瘤。通过过继转移分别由来自CD4+CXCL13+、CD4+CXCL13+和CD4+CXCL13−,CD8+CXCL13+和CD8+CXCL13− 的前3个TCR构建的T细胞来治疗PDX肿瘤每个患者肿瘤中的T细胞。未转导的T细胞作为对照。表达CD8+CXCL13+T细胞TCR的TCR-T细胞对来自P4（图4d）或P5患者（图4e）的自体PDX肿瘤显示出显著的治疗效果。对于用来自CD4+CXCL13+T细胞的TCR-T细胞，只有TCR对体外新抗原刺激呈阳性反应，显示出治疗效果。使用从CXCL13获得的TCR工程化T细胞进行治疗，未观察到任何治疗效果（图4d，e）。这些数据表明，用Tas-TCRs工程的TCR-T细胞可以有效治疗自体肿瘤。

由于Tas细胞在抗肿瘤免疫反应中起着至关重要的作用，通过CXCL13表达测定的肿瘤中这些细胞的水平可以预测对ICB的反应。从报告的临床试验中收集了不同癌症类型中ICB的客观缓解率（ORR），并发现CXCL13的中位表达与多种癌症类型中的ORR显著相关（图5a）。对ICB治疗前已发表的肿瘤样本RNA-seq数据的分析也表明，CXCL13的高表达与总体生存率的提高（图5b）和对ICB的更好反应（图5c）相关。进一步使用免疫组织化学（IHC）染色检测癌症切片上CXCL13的蛋白表达，发现CXCL13在CD4+和CD8+T细胞中特异表达（图5d）。与之前的报道一致，肿瘤中的三级淋巴结构（TLS）显示CXCL13的高表达，表明Tas细胞富含TLS。但在一些没有TLS的肿瘤中也观察到CXCL13的零星表达（图5d）。然后，在ICB治疗前收集黑色素瘤和结直肠癌（CRC）患者的肿瘤样本，并通过IHC检测CXCL13的表达。与已发表数据集的结果类似，这些患者中CXCL13蛋白的高水平与无进展生存率（PFS）的改善有关（图5e）。这些数据表明，代表肿瘤中Tas细胞丰度的CXCL13水平可以准确预测对ICB的反应。

表面标记物有助于从肿瘤中分离Tas细胞。因此，挑选了在CD4+或CD8+Tas细胞中高度表达的表面基因（图3b），并比较了它们在肿瘤T细胞簇中的表达（图6a）。结果发现CD200在CD4+CXCL13+Tas细胞中特异性表达，尽管在CD4+Treg中表达，但ENTPD1和LAYN可以区分CD8+CXCL13+Tas细胞与其他CD8簇。已发表的scRNA-seq数据的分析表明，CD4+CXCL13+和CD8+CXCL13+Tas细胞在所有9种分析的肿瘤类型中具有相似的特征（图6b），这表明这些标记物可以识别不同肿瘤类型的Tas细胞。然后，通过流式细胞术检测CD200和ENTPD1是否可以用于从肿瘤样本中分离CD4+和CD8+Tas细胞。LAYN没有接受检测，因为没有商用抗体。从患者肿瘤中分离出不同的免疫细胞亚群，并通过qPCR评估这些亚群中CXCL13的表达（图6c）。与scRNA-seq数据一致，CD4+CD200+和CD8+ENTPD1+T细胞的CXCL13表达明显高于相应的阴性T细胞（图6c）。此外，自体肿瘤细胞可以在体外激活CD4+CD200+和CD8+ENTPD1+T细胞（图6d）。这些数据表明，表面标记物CD200和ENTPD1能够分别通过FACS分选从肿瘤中分离CD4+和CD8+Tas细胞。

总之，利用scRNA-seq、TCR-seq和体外新抗原刺激，作者揭示了肿瘤中Tas细胞的特征。有几种标记物被鉴定出能特异性区分肿瘤中的CD4+和CD8+Tas细胞。进一步表明，用Tas-TCR工程的T细胞对自体PDX肿瘤具有显著的治疗效果。经鉴定的表面生物标记物能够通过FACS分选从肿瘤中分离Tas细胞。因此，作者开发了一种针对个性化TSA的TCR-T细胞疗法。总的来说，Tas细胞及其特异性生物标记物的鉴定为针对患者特异性肿瘤抗原的个性化TCR-T细胞治疗铺平了道路。基于这些发现，作者启动了一项个性化TCR-T细胞治疗实体瘤的临床试验。这种个体化的T细胞治疗策略可以通过增强患者体内自然产生的抗肿瘤免疫，产生高效、安全的抗肿瘤免疫反应，并为对现有免疫疗法产生耐药性的患者提供一种选择。

教授介绍

 周鹏辉教授2008年毕业于美国密西根大学（University of Michigan），获得免疫学博士，随后在哈佛大学医学院 (Harvard Medical School）进行博士后研究，2014年入选中山大学“百人计划二期”青年杰出人才。现为中山大学肿瘤防治中心，华南肿瘤学国家重点实验室教授、博士生导师。周鹏辉教授长期从事“肿瘤免疫学和肿瘤免疫治疗”研究。主要以覆盖全基因组的系统生物学方法，对肿瘤和免疫系统的互作进行系统性研究，鉴定新的治疗靶标，建立高效的肿瘤免疫治疗新方法，并研究其机理。研究成果发表于Nature，Proceedings of the National Academy of Sciences，Clinical Cancer Research等重要国际期刊。其中独创的高通量免疫治疗标靶筛选方法以Article形式发表于Nature (2014 Feb 6;506(7486):52-7)，并利用该方法成功筛选到大量的免疫治疗新靶标，为建立多靶标联合的肿瘤免疫治疗方法提供了技术基础，获得工业界和学术界的高度评价和广泛报道。

参考文献

He J, Xiong X, Yang H, et al. Defined tumor antigen-specific T cellspotentiate personalized TCR-T cell therapy and prediction of immunotherapyresponse. Cell Res. 2022;10.1038/s41422-022-00627-9.doi:10.1038/s41422-022-00627-9