hello，大家好，这一篇我们来看一下张泽民新发表的文章，Temporal single-cell tracing reveals clonal revival and expansion of precursor exhausted T cells during anti-PD-1 therapy in lung cancer，2021年12月23日发表于Nature Cancer，我们来分享一下.
先来简单总结一下全文
肿瘤浸润T细胞既包含能够识别肿瘤抗原并杀伤癌细胞的肿瘤特异性T细胞，也包含专门识别非肿瘤抗原例如流感病毒的T细胞，而且在肿瘤中非肿瘤特异性T细胞占了很大一部分比例。因此在分析过程中如何排除非肿瘤特异性T细胞的潜在影响，精准地研究肿瘤特异性T细胞的动态变化是一个挑战。之前的多个研究表明，由于肿瘤抗原的持续刺激，肿瘤中的肿瘤特异性CD8 T细胞克隆会同时高表达T细胞杀伤和“耗竭”相关基因，而非肿瘤特异性CD8 T细胞则不会表达“耗竭”相关基因。因此在肿瘤中，耗竭CD8 T细胞可以当作肿瘤特异T细胞的一个替代。
研究人员开发了一套新的分析思路，首先通过聚类分析鉴定了耗竭CD8 T细胞类群，进而以耗竭CD8 T细胞克隆的TCR序列为基础，将所有的CD8 T细胞分为肿瘤特异性CD8 T细胞和非肿瘤特异性CD8 T细胞：根据上面提到的结论和假设，与耗竭CD8 T细胞有完全相同TCR序列的细胞为肿瘤特异性T细胞，剩下的为非肿瘤特异性T细胞。研究发现在有响应的肿瘤当中，治疗显著提高了耗竭信号低的肿瘤特异T细胞前体细胞的比例，表明了PD-1抗体可能阻断了肿瘤特异T细胞向耗竭状态的分化。相反，这一趋势在治疗前和治疗后无响应的肿瘤中并没有观察到。
有效治疗后肿瘤特异T细胞前体细胞的增加有三种可能：1. 耗竭T细胞的逆转；2. 肿瘤中之前存在的前体细胞的扩增；3. 来自肿瘤外例如外周血中的T细胞的补充。研究者通过相关分析排除了第一种可能，强调了后面两种模式的重要性。耗竭T细胞的逆转是领域内长期存在的一种假设，但是之前的小鼠研究表明耗竭T细胞的表观修饰和特征是稳定的，很难改变。研究者对人类肿瘤的分析进一步支持了这一观点。
此外，之前斯坦福大学Howard Chang研究组提出了克隆替代（clonal replacement）的概念，认为治疗后肿瘤中的肿瘤特异T细胞的克隆型都是新出现的。而该研究发现，在肺癌治疗的过程中，新的克隆和之前存在的克隆都会被招募到肿瘤中进而发挥功能。针对这一现象，研究人员提出了克隆复兴（clonal revival）的概念，拓展了clonal replacement的模式。
Abstract
抗 PD-1 治疗在非小细胞肺癌 (NSCLC) 的治疗中显示出前所未有的临床成功，但其潜在机制仍未完全了解。在这里，对 36 NSCLC 患者接受基于 PD-1 的治疗的 47 肿瘤活检进行了时间单细胞 RNA 和配对 T 细胞receptor测序。观察到治疗后反应性肿瘤中前体耗尽 T (Texp) 细胞的水平增加，其特征是共抑制分子的低表达和 GZMK 的高表达。相比之下，无反应的肿瘤未能积累 Texp 细胞。数据表明，Texp 细胞不太可能来自终末耗竭细胞的重振；相反，它们是通过 (1) 局部扩张和 (2) 外周 T 细胞补充的新的和预先存在的克隆型而积累的，这里将这种现象称为克隆复兴。研究提供了对基于 PD-1 疗法的潜在机制的见解，暗示 Texp 细胞的克隆复苏和扩增是改善 NSCLC 治疗的步骤。
免疫检查点阻断 (ICB) 能够通过破坏共抑制性 T 细胞信号传导来增强抗肿瘤免疫，并代表了癌症治疗的显著范式转变。然而，对此类疗法的显著反应仅限于少数 NSCLC4 患者，这突出了对其他治疗策略的需求。为了促进下一代免疫疗法的合理设计，首先了解 ICB 诱导的肿瘤排斥反应的分子和免疫学机制至关重要。先前的研究报道，PD-1 通路阻断可以逆转慢性病毒感染期间终末耗竭的 Texp 细胞的功能障碍状态，呈现出一种广泛推测的 ICB 治疗机制。然而，通过集中精力解决这个问题，新出现的证据表明终端 Tex 细胞的表观遗传稳定性很难改变，可能会限制这种重振。最近的观察也支持了这一观点，表明新渗透的新克隆而不是预先存在的克隆在癌症治疗中起主要作用 。此外，多项研究已将临床结果与 Texp 细胞联系起来，包括干细胞样细胞和随后转化为终末 Tex 亚群的瞬态细胞，但终末 Tex 和 Texp 细胞在人类癌症治疗过程中对抗 PD-1 的反应仍然存在难以捉摸.
以前旨在阐明 ICB 治疗机制的肺癌研究集中在大块肿瘤的全外显子组测序上，但这些策略在理解免疫检查点阻断免疫反应的细胞基础方面是有限的。单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 是剖析复杂生物系统细胞多样性的有力方法，但目前对肺癌的 scRNA-seq 分析主要集中在未经治疗的肿瘤，主要是由于高水平的挑战- 在多个治疗时间点的高质量人类肿瘤样本。最近的一项肺癌研究分析了治疗后肿瘤中的新抗原特异性 T 细胞，而治疗后此类细胞的时间变化仍然难以捉摸。为了解决这些局限性，我们利用 scRNA-seq 分析来全面表征抗 PD-1 与化疗联合治疗后分离的肿瘤活检中 T 细胞的时间动态，使我们能够更好地解释基于 PD-1 的治疗的基本机制.
Result
Characterization of T cells pre- and post-PD-1 blockade by scRNA-seq
采用基于液滴的 5' scRNA-seq 和配对 T 细胞受体 (scTCR-seq) 测序来分析来自 36 名 NSCLC 患者的一组 47 份肿瘤活检，涵盖 33 名初治患者、9 名治疗后响应位点匹配的患者 （来自八个肿瘤）和五个治疗后无反应的肿瘤标本，在抗 PD-1 与化学疗法的联合治疗后。 经过严格的质量控制过滤（方法）后，总共剩下 135,391 个 Tcells，其中 56.6% 具有生产性 TCR α-和 β-链对（补充表 2）。 通过匹配 α 链和 β 链对，这些 T 细胞进一步分为 43,713 个不同的克隆型，使我们能够追踪克隆谱系并测量治疗后的克隆扩增。
在 CD4+ T 细胞中，我们发现反应性肿瘤在治疗后 FOXP3+ 调节性 T 细胞（Treg）略有减少，而治疗后无反应性肿瘤与反应性肿瘤相比，此类细胞显著增加。我们之前观察到 Treg 细胞内的异质性 ，其特征是 4-1BB (TNFRSF9) 的双峰分布，这是一种已知的 Treg 激活标记物。为了研究这种异质性是否与治疗反应相关，进一步对 Treg 进行了差异表达分析。与治疗后反应性肿瘤相比，治疗前和非反应性肿瘤中的 Treg 始终上调 4-1BB+ Treg 的特征，包括与免疫抑制功能相关的基因（IL1R2、REL 和 LAYN）。使用基因集富集分析（GSEA），进一步证明了 4-1BB+ Tregs 在无反应和治疗前肿瘤中的富集，这与之前的一项研究一致，该研究报告 4-1BB+ Tregs 与癌症基因组图谱肺腺癌患者的不良预后相关(LUAD)。与 Tregs 相比，表达 CXCL13 的 Th1 样细胞在治疗后表现出反应性肿瘤的增加。对 T 细胞克隆性的进一步检查显示，与无反应性肿瘤相比，反应性肿瘤中扩增的 Th1 样细胞显著增加，这支持此类细胞对 ICB 治疗的关键作用。使用先前发表的基底细胞癌 (BCC) 数据集，还观察到治疗后反应性肿瘤中 Th1 样细胞的富集，表明伴随肿瘤排斥的抗肿瘤免疫得到改善。
为了评估浸润的 CD8+ T 细胞，首先对剩余的肿瘤活检进行免疫组织化学 (IHC) 染色，并观察到 scRNA-seq 和染色数据之间 CD8+ T 细胞比例的显著相关性，这表明 scRNA-seq 可能反映，至少在部分，这些细胞群的真实浸润水平。在比较治疗反应之间的 CD8+ T 细胞群时，发现与无反应性肿瘤相比，反应性肿瘤表现出更高丰度的 CD8+ T 细胞，这与之前的观察结果一致，即 CD8+ T 细胞浸润到肿瘤中可以预测存活率和对免疫治疗的反应。为了进一步了解 CD8+ T 细胞对基于 PD-1 疗法的反应，对这 59,656 个 CD8+ T 细胞进行了聚类，并确定了三个广泛的细胞群——末端 Tex、未耗尽和增殖性 CD8+ T 细胞。终末 Tex 细胞的特点是耗竭特征的高表达，包括 PDCD1、CTLA4 和 HAVCR2。Emerging evidence demonstrates that terminal Tex cells in tumors are specifically derived from tumor-specific Tcells, whereas Tcells responsible for acute infections do not give rise to Tex cells.Thus, a terminal Tex subset could be used as a proxy for a tumor-reactive T-cell compartment. 为了进一步支持这一观点，分析了先前报道的肿瘤抗原特异性 T 细胞的特征基因——ENTPD1 和 ITGAE——并发现它们在末端 Tex 子集中特异性表达。此外，进一步检查了三个先前发表的肿瘤特异性 CD8+ T 细胞数据集，发现这些细胞始终高度表达一组耗竭特征基因，与我们数据中的终端 Tex 子集有着深刻的相似性。以往的研究表明，PD-1通路阻断可以在一定程度上改善慢性病毒感染过程中末端Tex亚群的效应功能。为了确定是否可以在人肺癌中观察到这种现象，我们对那些报道的效应基因进行了 GSEA 分析。并且，事实上，在响应性肿瘤治疗后，这些基因的末端 Tex 子集显著富集，表明它们在治疗后效应功能得到改善.
为了解决肿瘤消退是否主要由末端 Tex 细胞驱动，如其他癌症类型所示，进一步分析了末端 Tex 细胞频率的变化并观察到两种不同的模式。对于治疗前具有低终末 Tex 浸润的反应性肿瘤，PD-1 阻断优先增加此类细胞的比例，提示治疗后肿瘤反应性 T 细胞浸润增加或扩增，这与之前的临床观察一致，即耗竭样 T 细胞与人类黑色素瘤和乳腺癌的抗 PD-1 疗法有关。相比之下，具有高基线终末 Tex 浸润的肿瘤表现出相反的模式，这些细胞的相对频率急剧下降，表明除了终末 Tex 细胞外，其他细胞群也可能在肿瘤控制中发挥重要作用。由于多项小鼠研究表明抗 PD-1 也可以靶向 Texp 细胞以增强抗肿瘤免疫，我们接下来试图确定这些前体以解决终末 Tex 细胞比例的波动。
Tex precursors within the tumor
分析 Texp 细胞的典型程序是首先通过聚类来识别不同的细胞组，然后检查与终端 Tex 子集具有最多共享 TCR 的cluster。然而，之前的分析表明，此类cluster可能包含与末端 Tex 和血液效应细胞独立连接的 TCR，这意味着未耗尽的肿瘤反应性 T 细胞和潜在的旁观者细胞可能由于相似的转录表型而落入同一cluster。为了更好地识别和表征 Texp 细胞，应用了基于 TCR 的选择策略，主要考虑两个方面：（1）通过基于耗竭标记的高表达的无监督聚类，可以很容易地将终端 Tex 子集与其他细胞区分开来，以及（ 2) TCR 提供了一个可靠的分子标签来追踪 Tex 细胞的谱系。因此，在这里只选择了与终端 Tex 细胞共享 TCR 的终端 Tex 和未耗尽的 CD8+ Tcell，并对这些细胞应用了无监督聚类。除了终末和增殖性 Tex 细胞外，还确定了两种非衰竭细胞状态，其中 TCR 与终末 Tex 子集 GZMK+NR4A2-和 GZMK+NR4A2+ Tcells 共享，每个都有其独特的特征基因。两个cluster都显示共抑制分子的表达减少，而 GZMK 的表达增加。
以前的小鼠研究已经定义了 Tex 细胞的详细发育框架，因此我们使用报告的干细胞、暂时性和终末 Tex 细胞的特征基因进行了进一步的 GSEA 分析，以更好地表征人肺癌中 Tex 亚群特异性生物学。可以肯定的是，GZMK+NR4A2–/+ 细胞与 Beltra 等人定义的中间 Tex 细胞具有最高的相似性。GZMK+NR4A2–/+ 细胞也显示出与 Beltra 等人定义的 Texprog2 细胞高度相似，尽管与 GZMK+NR4A2+ 细胞相比，GZMK+NR4A2– 细胞具有更强的富集。值得注意的是，研究中的终端 Tex 细胞被选择性地富集了小鼠 Tex 细胞的终端分化特征，证明了该cluster的稳定性。此外，对常驻记忆和循环 T 细胞特征的分析显示，从 GZMK+NR4A2– 到 GZMK+NR4A2+ 细胞，再到末端 Tex 细胞，组织驻留表型增加，循环表型显示相反的模式。使用先前发表的肺癌 Smart-seq2 数据进行的类似分析进一步证明了 GZMK+NR4A2–/+ 细胞的前体表型和末端 Tex 子集的稳定性。这些分析为从 GZMK+NR4A2– 到 GZMK+NR4A2+ 细胞，再到末端 Tex 细胞的逐步发育程序提供了宝贵的见解，RNA velocyto分析进一步支持了这种潜在的分化轨迹，尽管需要额外的功能验证。总之，使用基于 TCR 的选择方法，发现 GZMK+NR4A2–、GZMK+NR4A2+、终末和增殖性 Tex 细胞是人类肺肿瘤中存在的四种转录不同的 Tex 细胞群。为清楚起见，GZMK+NR4A2–/+ 子集在此称为 Texp1 (GZMK+NR4A2–) 和 Texp2 (GZMK+NR4A2+) 细胞
CXCL13 expression in Tex cells
当将 Tex（终端 Tex 和 Texp）细胞与那些与终端 Tex 子集（Tex 无关细胞）不共享 TCR 的 CD8+ Tcell 进行比较时，发现 CXCL13 在终端 Tex 和 Texp 细胞中高度且仅表达。 Tex 细胞产生的 CXCL13 可以介导免疫细胞向肿瘤募集，并且可能是形成三级淋巴结构的驱动因素之一。然而，先前对未经治疗的肿瘤的研究报告称，CXCL13 仅由末端 Tex 子集表达。为了解决这个问题，分析了处理前后 Texp 细胞中 CXCL13 的表达，发现 CXCL13 仅在处理后的 Texp 细胞中高表达，而不是预处理。为了进一步验证这一点，收集了来自 NSCLC 和其他癌症类型的四个已发表的未经治疗的 T 细胞数据集，试图调查 CXCL13 在肿瘤浸润 CD8+ T 细胞中的表达。为了解决由dropout事件引入的潜在偏差，应用 MetaCell 算法来识别同质细胞组 - meta细胞，其分析揭示了耗竭评分与 CXCL13 表达之间的显著相关性。此外，发现 CXCL13 在所有分析的癌症类型的末端 Tex 子集中高度且唯一地表达，在 Texp 和其他 CD8+ T 细胞中几乎检测不到表达。为了进一步探索 CXCL13 的表达，专注于具有匹配血样的数据集，并分析了外周 Tex-TCR 共享 CD8+ T 细胞的表达，这些细胞处于非耗竭状态，可以很容易地与终端 Tex 子集区分开来。值得注意的是，CXCL13 在外周 Texp 细胞中仅表现出罕见的表达，这意味着仅当细胞处于肿瘤微环境中时 CXCL13 才会上调。最近的研究表明，在同时存在 TCR 刺激和 TGF-β 受体信号传导的情况下，CXCL13 被 CD8+ T 细胞上调，进一步支持了这样的观点，即在未接受治疗的肿瘤中，肿瘤反应性 T 细胞中 CXCL13 的上调是沿着耗竭轴的由于慢性抗原刺激。因此，分析结果暗示，那些治疗后表达 CXCL13 的 Texp 细胞可能是通过 PD-1 抗体阻断向终末 Tex 细胞的转变而形成的，而 CXCL13 表达不受影响。
Accumulation of Texp cells in responsive tumors after treatment
为了进一步检验上述假设并解决终端 Tex 细胞的减少，接下来研究了 Texp 细胞的丰度在治疗过程中是如何变化的。在 14 个治疗后肿瘤样本中，13 个来自原发性肺肿瘤 (n=7) 或淋巴结转移 (n=6)。因此，首先评估了 Tex 子集在不同类型的活检部位之间是否具有可比性，并发现这些populations可以通过无监督聚类和监督细胞类型分类一致地捕获，证明它们的稳定性。为了能够精确评估 Tex 子集比例，接下来分析了每个肿瘤中的每个显性高置信度 Tex 克隆。关注响应性肿瘤，观察到来自治疗前肿瘤的大多数 Tex 细胞处于最终耗尽状态，而治疗后的 Tex 细胞富含 Texp 细胞，并且在八个响应性肿瘤中的六个中一致观察到这种模式（P010、P013 、P019、P030、P033 和 P035）。值得注意的是，由于 Tex 细胞计数较低 (<30)，其中一种反应性肿瘤 P029 未包括在该分析中。对反应性肿瘤中每个显性 Tex 克隆的进一步差异表达分析显示，与治疗前相比，治疗后的 Tex 细胞始终表达较低水平的耗竭基因，支持 Texp 细胞响应治疗而增加。通过对来自四个初治和三个治疗中反应性肿瘤的剩余活检材料进行多色 IHC 染色，证实了表达 CXCL13 的 Texp 细胞（CD8A+CXCL13+TIM3–）和末端 Tex 细胞（CD8A+CXCL13+TIM3+）的存在）。此外，表达 CXCL13 的 Texp 细胞在处理后显示出更高的丰度，这与我们的 scRNA-seq 数据一致。
接下来，将分析重点放在治疗后无反应的肿瘤以及剩余的未经治疗的肿瘤上。与预处理响应样本一样，这些肿瘤未能积累 Texp 细胞，其中终端 Tex 子集占主要比例。因此，与反应性肿瘤相比，治疗后无反应性肿瘤中的 Tex 细胞表现出整体更高的耗竭特征表达水平，证明了 Texp 细胞在癌症治疗中的重要性。接下来将 Tex 无关细胞与 Tex 细胞进行了比较，以试图进一步了解前者对治疗的反应。通过使用先前开发的 STARTRAC 指数定义克隆扩增，观察到与 Tex 无关的细胞相比，Tex 细胞表现出显著更高的扩增水平，支持 Tex 克隆的肿瘤特异性。此外，对 Tex 无关细胞cluster的仔细检查显示，这些亚群在治疗后并未始终显示出更高的克隆扩增，这表明 Tex 亚群可能是先前报道的对基于 PD-1 的疗法有反应的主要细胞类型，尽管未来的研究需要验证
为了解决 Texp 细胞的作用是否仅在肺癌治疗期间存在，分析了来自反应性 BCC、鳞状细胞癌 (SCC) 和黑色素瘤肿瘤的 ICB 治疗前后 CD8+ T 细胞的三个现有数据集。由于基于 TCR 的 Texp 细胞识别需要在处理前和处理后捕获大克隆，这可能不适合这些数据集，因此随后进行了基于meta细胞的计算机荧光激活细胞分选 (FACS) 以区分表达 CXCL13 的细胞来自其他细胞的 Texp 细胞。值得注意的是，这种方法很容易在我们的数据中识别终端 Tex 和 CXCL13+ Texp 细胞，并产生类似于基于 TCR 选择的聚类的结果。对 BCC 和 SCC 的进一步分析显示，PD-1 阻断后末端 Tex 细胞增加，表明肿瘤内肿瘤反应性细胞数量增加，但在这两种癌症类型中未观察到 CXCL13+ Texp 细胞，这可能是由于更大程度的免疫抑制在肿瘤微环境（TME）中。接下来检查了黑色素瘤中的 CXCL13+ Texp 细胞。与我们的数据相似，这些细胞在治疗后在反应性肿瘤中富集，在无反应性肿瘤中几乎检测不到丰度。总的来说，我们的分析表明（1）治疗后黑色素瘤中 Texp 细胞也可能增加，（2）Tex 细胞可能对不同癌症类型的 ICB 治疗有不同的反应，尽管需要进一步研究来调查这一点。
Local expansion of pre-existing Texp cells
关于我们数据中发现的 Texp 细胞增加的一个重要问题是这些细胞的来源。 三种可能的模式可以解释 Texp 细胞的形成：（1）通过处理将末端 Tex 亚群重编程为 Texp 细胞； (2) 预先存在的 Texp 细胞的局部扩增； (3)用外周T细胞补充。 关于其中的第一个，Pauken 等人先前对小鼠淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒 (LCMV) 进行了研究。 证明末端 Tex 细胞由于其表观遗传稳定性而无法获得记忆 T 细胞表型，与本报告一致，我们上述 RNA velocyto分析揭示了从 Texp 到末端 Tex 细胞的清晰单向流动，支持不可逆分化为终末耗竭的 T 细胞，尽管进一步需要对人类肿瘤衍生的终末 Tex 细胞进行直接测试。
接下来评估了预先存在的 Texp 细胞是否可以响应治疗而扩增。尽管 Texp 细胞丰度低，但它们确实在预处理肿瘤中被识别出来，这得到了对单个 Tex 克隆的更仔细检查的进一步支持。针对反应性肿瘤，发现在治疗前肿瘤中可以检测到相当大一部分治疗后 Tex 克隆型，相当于治疗后 Tex 细胞的 62.2%。此外，这种重新出现的（预先存在的）克隆型在大尺寸上显著富集，表明它们在肿瘤抗原识别和进一步的抗肿瘤活性中起主要作用。为了进一步验证第二种模式，随后将分析重点放在预处理增殖性 Tex 细胞上，以研究该cluster是否包含某些 Texp 细胞。在这里，使用基于 metacell 的 in silico FACS 来区分 Texp 和终端 Tex 细胞。作为一个测试案例，我们首先表明这种方法可以有效识别小鼠 LCMV 模型中的祖细胞 (Tcf1+) 和末端 Tex 细胞，准确率为 98.1%。当将这种方法应用于我们的数据时，我们在预处理肿瘤内鉴定了增殖性 Texp 细胞，证明可能发生预先存在的 Texp 细胞的扩增，并且是 Texp 细胞响应治疗而积累的重要模式。
Clonal revival of tumor-specific T cells
除了处理前和处理后都存在的克隆外，通过进一步分析处理前不存在的新克隆来探索 Texp 细胞增加的现象，发现这些新克隆也表现出相对于克隆而言更高比例的 Texp 细胞。 之前有人提出新的 Tex 克隆来自肿瘤外的位点，这促使我们认为我们研究中重新出现的克隆，就像新克隆一样，除了局部扩增模式外，也可能用最近招募的新鲜细胞进行补充
为了进一步研究 Texp 细胞是否可以从外周补充，我们对匹配的治疗前和治疗后血液样本进行了批量 TCR-seq，用于四个响应样本，发现在肿瘤组织中扩增的那些克隆型也可以在血液中检测到。此外，通过将肿瘤中的所有共享克隆型与血液中的克隆型进行匹配来扩展我们的分析，并观察到克隆大小的普遍且显著的相关性，这与先前的观点一致，即外周 T 细胞可以作为肿瘤内 T 细胞池提供。为了进一步证明这一观点，分析了外周血治疗后出现的新的瘤内 Tex 克隆型的克隆丰度。值得注意的是，大多数新的 Tex 克隆型 (87%) 仅在治疗后的血液中检测到，支持在治疗后激活具有新肿瘤抗原特异性的新克隆。有趣的是，对于那些治疗后预先存在的肿瘤内 Tex 克隆型也观察到了类似的模式，63% 的预先存在的 Tex 克隆型仅在治疗后的血液中检测到，并且许多此类克隆型在治疗前在肿瘤中是大尺寸的。为了解决这种现象是否由潜在的测序偏差引起，我们分析了已发布的 BCC 数据集，并进一步证实了治疗后血液中重新出现的 Tex 克隆型的富集。治疗可能增强了肿瘤反应性克隆的激活和扩增，导致外周血中此类克隆的丰度增加。
尽管外周和瘤内 T 细胞共享 TCR，但 Texp 细胞迁移的方向尚不清楚。 为了进一步解决这个问题，对 P019 的剩余冷冻治疗后血样进行了配对 scRNA-seq 和 scTCR-seq，其采样时间点与治疗后肿瘤活检的采样时间点相同，但 CXCL13 均不表达 在这些外周 Texp 和其他 CD8+ T 细胞中。 为了解决这一观察结果是否是由于dropout事件，对治疗后的瘤内 Texp 细胞进行了排列分析，以估计平均 CXCL13 表达的分布，并且该分析进一步证明了外周和瘤内 Texp 细胞之间 CXCL13 表达的差异。 我们的数据以及之前的报告支持 T 细胞向肿瘤的迁移，尽管需要更直接的证据来证实这种迁移方向
正如我们的分析表明，除了用新的 Tex 克隆进行克隆替换外，与预先存在的 Tex 克隆共享相同克隆型的细胞可以被重新激活并在治疗后进一步进入肿瘤。为了进一步了解新的和重新出现的（预先存在的）Tex 克隆在癌症治疗过程中的贡献，我们将我们的数据与已发布的 BCC 和 SCC 数据集相结合，并将治疗前肿瘤中 Tex 克隆的数量与重新出现的比例进行匹配处理后的 Tex 克隆。很明显，重新出现的 Tex 克隆的频率随着预处理 Tex 克隆的数量而单调增加。该分析表明，大多数 BCC 肿瘤的基线 Tex 浸润较低，因此阻断 PD-1 将增强新 Tex 克隆的扩增和浸润，大概是通过促进新肿瘤新抗原的处理。相比之下，肺癌样本往往是“热肿瘤”，治疗前的肿瘤内 Tex 克隆库已经包括大量肿瘤特异性克隆型。总的来说，我们的数据表明，新的和预先存在的 Tex 克隆在癌症治疗中都可能很重要，我们将治疗后外周 T 细胞补充的现象称为“克隆复兴”，作为对以前的确认和延伸克隆替换模型。
Discussion
在这项研究中，我们利用 scRNA-seq 来了解抗 PD-1 与化疗联合治疗的机制。 使用基于 TCR 的谱系追踪，我们确定了人类肺癌中存在的两种 Texp 细胞状态，这些状态与 GZMK 的高表达和衰竭特征的低表达相关。 这些 Texp 细胞在治疗后反应性肿瘤中显著增加，并且可能是对基于 PD-1 的疗法有反应的主要细胞类型，这与之前的研究一致。 我们的数据表明，这些 Texp 细胞不太可能来自终端 Tex 子集的恢复； 相反，它们是通过克隆复苏和预先存在的 Texp 细胞的扩增而积累的，提供了对 ICB 治疗机制的见解。
尽管某些 NSCLC 肿瘤中存在高基线 Tex 浸润细胞，但仅在治疗后的血液中检测到肿瘤中许多预先存在的 Tex 克隆型。 一种可能的解释是，随着肿瘤进展的免疫抑制活性增加，在早期癌症阶段激活的某些肿瘤反应性克隆随着时间的推移在血液中逐渐减少。 通过基于 PD-1 的治疗，这些克隆被激活和扩展，导致血液中的丰度增加。 此外，新的和预先存在的 Tex 克隆的克隆复苏表明，除了局部扩增外，新招募的 Texp 细胞，无论是来自外周还是其他来源，如淋巴器官，可能是成功治疗的另一个关键因素，尽管各自的 这两种模式对抗肿瘤免疫的贡献需要进一步研究。
Our analysis revealed that ICB treatment in different cancer types may have varied effects on Tex cell subsets. BCC and SCC tumors exhibited a notable expansion of terminal Tex cells in response to ICB and this expansion was also observed in a recent breast cancer study, whereas lung cancer and melanoma tumors tended to accumulate Texp cells, with terminal Tex cells dramatically decreased following treatment. This difference was possibly due to a variable degree of immunosuppression in different cancer types, or to the concurrent chemotherapy used in these patients with lung cancer. Future therapeutic strategies to enhance the accumulation of Texp cells may further improve the clinical response of these cancers. In this study, we considered terminal Tex cells as a proxy for a tumor-reactive T-cell compartment and performed subsequent analysis based on these Tex clonotypes, although future in vitro experiments would be needed
to demonstrate tumor specificity. Given the challenge in collecting consecutive clinical tumor biopsies from patients with NSCLC before and during anti-PD-1 treatment, limited samples were used in this study and thus future work based on larger cohorts of anti-PD1-treated patients is needed to generalize our findings. In addition, our results are mainly based on transcriptomic data and further functional experiments are required for validation.
Methods
张泽民老师很喜欢python的单细胞处理软件scanpy啊~~~
Metacell的算法还是要认真研究一下
生活很好，有你更好
