hello，大家好，在昨天分享的文章10X单细胞、VDJ、空间转录组助力研究转移性黑色素瘤的免疫图谱，提到了记忆CD8⁺ T细胞分为两种，常驻记忆（T_rm）和循环记忆（T_cirm）细胞,两种细胞对于抗肿瘤都起到了关键的作用，但上一篇主要是研究各个组织的T_rm对于抗肿瘤扩散的关键作用，而今天，我们要讨论一下淋巴结处的CD8⁺ T细胞的抗肿瘤特性，参考文章在A reservoir of stem-like CD8⁺ T cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response，2021年10月发表于Science Immunology，IF18分，值得借鉴。

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Abstract

“干细胞样” TCF1⁺ CD8⁺ T (T_SL) 细胞对于 T 细胞反应的长期维持和免疫治疗的疗效是必要的，但是，由于肿瘤包含驱动 T 细胞终末分化的信号，这些细胞如何在肿瘤中维持还不清楚。在这项研究中，发现在肺肿瘤的整个发展过程中都存在少量 TCF1⁺ 肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞。然而，大多数瘤内 T 细胞随着肿瘤的进展而分化，对应于肿瘤微环境 (TME) 从“热”（T 细胞发炎）到“冷”（非 T 细胞发炎）的免疫转变。相比之下，tumor-draining lymph nodes (dLN) 中的大多数肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞具有与慢性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒感染的 T_SL 相似的功能和基因表达特征，并且尽管 TME 发生了变化，但该群体随着时间的推移保持稳定。 dLN T 细胞是其分化程度更高的肿瘤内对应物的发育前体，并且与其克隆相关。分析的数据支持以下假设：dLN T 细胞是肿瘤中 TCF1⁺ T 细胞的发育前体，通过持续迁移维持。最后，与 T_SL 相似的 CD8⁺ T 细胞也存在于肺腺癌患者的淋巴结中，这表明类似的模型可能与人类疾病相关。因此，猜想 dLN T_SL 储库在肿瘤发展过程中维持抗肿瘤 T 细胞和保护它们免受 TME 中发生的终末分化方面具有关键作用。

INTRODUCTION

非小细胞肺癌 (NSCLC) 是最致命的癌症之一，但免疫检查点抑制剂 (ICI)，如抗程序性细胞死亡 1 (PD-1) 和抗程序性死亡配体 1 (PD-L1)，具有在约 20% 的接受治疗的 NSCLC 患者中提供了持久的反应。几个参数与反应呈正相关，包括存在免疫“热”肿瘤微环境（TME；包含浸润的 CD3⁺ T 细胞，也称为 T 细胞发炎）、PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞的浸润、PD-L1 对肿瘤的免疫染色和免疫细胞，以及增加的肿瘤突变负荷/新抗原。这些观察结果与 PD-1 阻断增强热肿瘤中“耗尽”的 PD-1⁺ 肿瘤浸润 CD8⁺ T 细胞功能的想法一致。相比之下，免疫学“冷”肿瘤（也称为“免疫排斥”或“非 T 细胞发炎”）的患者对免疫治疗反应不佳，其抗肿瘤 CD8⁺ T 细胞反应的状态尚不确定。由于免疫疗法的反应率低，特别是对于冷肿瘤患者，更好地了解与热肿瘤和冷肿瘤相关的 CD8⁺ T 细胞生物学至关重要。

CD8⁺ T 细胞耗竭是一个渐进的终末分化过程。 耗竭的 T (T_EX) 细胞的特征是丧失增殖潜能和效应功能 [产生肿瘤坏死因子-α (TNFα) 和干扰素-β(IFNβ) 的能力]，以及几种抑制性受体的表达增加 （例如，PD-1 和 Tim3）和转录因子（例如，Blimp-1、Tox 和 Eomes）。 T_EX 细胞来源于分化程度较低的前体，包括 PD-1^mid CXCR5⁺ SLAMF6⁺ TCF1⁺ “茎样”T (T_SL) 细胞。 TCF1⁺ T_SL 细胞在慢性免疫反应中至少有两个功能：维持正在进行的 T 细胞反应和介导对 PD-1 阻断的治疗反应。 T 细胞因子 1 (TCF1) 的表达对于这两种功能都是必需的，因此为识别 T_SL 细胞提供了重要工具。

TCF1⁺ CD8⁺ T 细胞存在于肿瘤中，它们的存在与免疫治疗后的更好结果相关。 然而，肿瘤富含促进 CD8⁺ T 细胞耗竭的信号，例如持续的抗原暴露。 这就提出了一个基本问题：在自然肿瘤发展过程中，肿瘤内 TCF1⁺CD8⁺T 细胞是如何维持数月至数年的？ 此外，因为 TCF1 表达是维持 T 细胞群所必需的，所以免疫学上的冷肿瘤是否是由于肿瘤内 TCF1⁺ CD8⁺ T 细胞的丢失造成的？(这个问题很重要)

KP（Kra^{slox-stop-lox (lsl)-G12D/+}；p53^flox/flox）模型是一种基因工程小鼠癌症模型，它忠实地再现了发展中的人类肺腺癌 (LUAD) 的组织学、转录组学、表观基因组学和遗传特征) 并在我们了解人类肺癌的发展过程中发挥了重要作用。 KP 模型中的肿瘤可以被编程为表达新抗原，这允许研究正在发育的肿瘤中的肿瘤特异性 T 细胞反应。早期表达新抗原的 KP 肺肿瘤被肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞浸润，并具有免疫学热的 TME。然而，随着肿瘤的发展，它们会出现免疫学上的冷 TME，T 细胞被排除在肿瘤实质之外，并被限制在三级淋巴结构 (T_LS) 中。因此，KP 模型为我们提供了一个机会来研究来自热和冷 TME 的 T 细胞之间的差异，并评估在肿瘤生长过程中如何维持肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞的机制。

RESULTS

Tumor-specific TCF1⁺ CD8⁺ T cells are present throughout disease progression

为了研究表达新抗原的肺肿瘤中肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞反应，我们用单独表达 Cre 的腺病毒或慢病毒（Ad5mSPC-Cre 或 lenti-Cre）气管内感染 KP-NINJA 小鼠（KP × R26-NINJA × CCSP-rtTA Tg）。 在该模型中，受感染的肺上皮细胞中的 Cre 表达会激活 Kras G12D 并消除 Trp53。 新抗原在肿瘤细胞中的表达 [来自淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒 (LCMV) 糖蛋白的 GP33-43 和 GP66-77] 由多西环素和他莫昔芬治疗在感染后 7 至 10 天开始 (p.i.) 开始。 Cre 暴露的细胞在给予强力霉素和他莫昔芬之前保持新抗原阴性，允许肿瘤起始和新抗原诱导的时间分离。 最早在感染后 8 周内可检测到肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞，肿瘤开始后逐渐发展。 感染后 16 至 20 周时肉眼可见的大块肺肿瘤。
先前的研究表明，早期肿瘤和晚期肿瘤之间存在从热肿瘤到冷肿瘤的转变。 为了证实这一点，我们通过 CD3 免疫组织化学 (IHC) 染色量化了 8 周和 16 至 20 周肿瘤中的 T 细胞浸润。 KP-NINJA 模型中的肿瘤经历了从免疫热到免疫冷 TME 的转变。 这种转变不是由于肿瘤抗原的丢失，因为由 20 周肿瘤制成的细胞系表达的新抗原具有主要组织相容性复合体 (MHC) I 类和 PD-L1 的可诱导表达，并引发 GP33 和 GP66 特异性 CD8⁺ 和 CD4 移植后的 T 细胞反应（分别）。 因此，假设从热 TME 到冷 TME 的转变可能反映了动物体内肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞在晚期时间点的整体耗竭。

为了验证假设，分析了早期（8 至 10 周）和晚期（16 周以上）瘤 KP-NINJA 小鼠肺组织肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞上 TCF1 和 PD-1 的表达。出乎意料的是，在研究的两个时间点，肿瘤中都有一群 TCF1⁺PD-1⁺CD8⁺T 细胞，其数量没有随着肿瘤进展而发生实质性变化。尽管如此，在早期和晚期时间点之间，肿瘤内终末分化的 Tim3⁺ TCF1-PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞的比例显着增加（早期 3.7% 至 7.9%）。肿瘤中的一部分 TCF1⁺PD-1⁺CD8⁺T 细胞也在早期 (~38%) 和晚期 (~67%) 时间点表达 T_SL 标志物信号淋巴细胞活化分子家族成员 6 (SLAMF6)。相比之下，SLAMF6⁺ 的瘤内 TCF1^-PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞显着减少（早期约 2% 至晚期约 7%）。当肿瘤被编程为在 NINJA 中用含有新抗原的慢病毒表达新抗原时，也看到了类似的结果，这表明 T 细胞分化与用于新抗原编程的方法无关。总之，这些数据表明晚期 KP 肿瘤中的冷肿瘤表型可能不是由于 TCF1⁺ CD8⁺ T 细胞的丢失。(假设被否定了)

在整个肿瘤发展过程中，肿瘤特异性 TCF1⁺PD-1⁺CD8⁺T 细胞的存在很有趣，因为它表明存在维持肿瘤内这一群体的机制。我们推断这可能是由于 TCF1⁺ 细胞的局部维持和/或从远端部位迁移所致。因此，评估了来自 KP-NINJA 小鼠的 TCF1⁺PD-1⁺CD8⁺T 细胞的引流淋巴结 (dLNs) 并确定了肿瘤特异性 CD8⁺T 的~65(±2.8)% 和~74(±2.4)%在肿瘤发生后 8 至 10 周和 16+ 周，dLN 中的细胞分别为 TCF1⁺ 和 PD-1⁺。与肿瘤相比，dLN 中 TCF1⁺PD-1⁺GP33 特异性 CD8⁺T 细胞数量增加了约 10 倍。从表型上看，dLN 中的这个群体随着时间的推移显得相当稳定，并且在整个肿瘤发展过程中主要保持 Tim3^-。此外，早期 (80.6 ± 3.54%) 和晚期 (96.7 ± 0.98%) dLN 中的大多数 TCF1⁺PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞是 SLAMF6⁺。从功能上讲，尽管在体外 GP33-41 肽再刺激后，来自肿瘤的一部分 T 细胞产生了 IFNγ（5.2±1.8%），但来自 dLN 的 T 细胞似乎具有增强的功能能力，因为 IFNγ+ 的比例增加了 10 倍再刺激 (59 ± 10.4%)。总之，这些数据表明 dLN 中的大多数肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞是 TCF1⁺ 和 SLAMF6⁺，并且这些细胞中有相当一部分具有功能能力。调查的所有其他组织，包括脾脏、胸腺、骨髓、腹股沟和肠系膜 LN，不包含可观的 GP33 特异性 TCF⁺PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞群。

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TCF1⁺ CD8⁺ T cells are enriched in dLNs in an orthotopic lung tumor model

为了在第二个肿瘤模型中验证我们的结果，使用源自 KP-NINJA 小鼠（20 周 p.i.）的晚期肿瘤的细胞系 (KPN1) 建立了原位肺肿瘤移植模型。 移植后第 10 天和第 20 天对 dLN 和肿瘤中 GP33 特异性 CD8⁺ T 细胞的分析表明，在两个时间点肺中都存在 TCF1⁺PD-1⁺ T 细胞，但也存在大量 TCF1⁺PD -1⁺ dLN 中的 T 细胞。 此外，它们在 dLN 中的频率和数量更大。 因此，使用第二个模型，我们证实 dLN 是肿瘤特异性 TCF1⁺PD-1⁺CD8⁺T_SL 细胞大量富集的位点。

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Heterogeneous tumor-specific CD8⁺ T cells include populations of T_SL and T_EX similar to those present in chronic LCMV infection

为了了解肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞在早期和晚期时间点的分化，我们荧光激活细胞分选 (FACS) 分选了来自 KP- NINJA 小鼠 8 周（早期）和 17 周 pi （后期）并使用 T 细胞受体 (TCR-seq) 的配对 V(D)J 测序进行单细胞 RNA 测序 (RNA-seq)。 在慢性 LCMV 感染的背景下已经很好地描述了耗竭的 CD8⁺ T 细胞谱系，KP-NINJA 模型的一个优势是内源性 GP33 特异性 CD8⁺ T 细胞识别与急性 (Armstrong) 中存在的相同的抗原肽 和慢性（克隆 13）LCMV。 我们还在注射后 28 天从 C57BL/6 小鼠的脾脏中 FACS 分选了内源性 GP33 特异性 CD8⁺ T 细胞。 使用 LCMV Clone 13 或 LCMV Armstrong 并进行单细胞 RNA-seq 和 TCR-seq。 然后我们直接比较了分类的抗肿瘤和抗病毒 T 细胞的转录组。
分析了来自慢性 LCMV 感染的单细胞 RNA-seq 数据，以确定符合先前对naive、“前体耗尽”T_SL、“暂时性”/迁移效应 T 细胞和终末耗尽 T_EX 细胞描述的cluster。对来自慢性感染的 GP33 特异性 CD8⁺ T 细胞的无偏聚类分析揭示了聚类，并且根据先前与慢性 LCMV 中 T 细胞亚群（幼稚相关、祖细胞相关、迁移相关、和疲惫有关）。还包括编码 T 细胞效应分子的基因、与 CD8⁺ T 细胞分化相关的转录因子以及与 TCR 信号相关的基因。根据基因表达模式，我们确定了最能代表naive（cluster 5）、T_SL（cluster 2）、迁移（cluster 7 和 0）和 T_EX（cluster 1）细胞群的cluster。除了所选基因的表达之外，基于亲和力的过渡嵌入（PHATE（关于PHATE，大家可以参考我的文章10X单细胞降维分析之PHATE））的热扩散的无偏潜力概括了clusters之间的预期谱系关系，表明从 T_SL 到迁移或 T_EX 细胞的逐步分化。
我们接下来分析了来自肿瘤和 dLN 的个体样本。对单个样本的无偏聚类分析表明，每个样本都包含几个群体，包括一组具有强烈初始 T (T_N) 细胞特征的细胞，我们假设这些细胞在我们的 GP33 特异性 T 细胞种类中污染了 CD8⁺ T 细胞。使用 TCR-seq 数据，我们确认 T_N 细胞cluster完全由具有独特 TCR 序列（即单峰）的 T 细胞组成，而非 T_N 细胞cluster包含具有与其他 T 细胞“共享”的 TCR 的 T 细胞在样本中。 dLN T 细胞的分析表明，在大多数细胞中，祖细胞、迁移和衰竭相关基因以及效应分子和转录因子基因的表达相对一致。相比之下，肿瘤样本中 T 细胞中这些基因的表达存在更多异质性。还对来自祖细胞相关、迁移相关、耗竭相关、效应分子、转录因子、TCR 信号传导和naive相关类别的其他基因进行了分析。
为了比较肿瘤、L_N 和慢性 LCMV 样本之间的 T_SL 和 T_EX T 细胞亚群，我们共同嵌入了所有五个数据集（早期和晚期 dLN 以及肿瘤和慢性感染），并将它们与 PHATE 的共同嵌入可视化。 我们确定了 12 个cluster，并且根据它们对特征panel基因的表达，我们确定了 naïve（cluster 0、2 和 10）、T_SL（cluster 5、4 和 6）、迁移（cluster 8 和 1）以及 T_EX（cluster 11 和 3）细胞。
这三个 T_SL cluster包括一个主要由来自慢性感染的细胞（cluster 5）和一个主要由来自两个 dLN 样本的细胞组成的cluster（cluster 4）。 这些cluster具有相似的基因表达模式，尽管 Cd200 和 Pdcd4 存在显着差异。 cluster 6 主要由来自早期肿瘤的细胞组成，并且除 Tcf7 外，大多数祖细胞相关特征基因的表达均较低。 这些数据表明，与肿瘤中的 TCF1+ 对应物相比，dLN 中的 TCF1⁺ SLAMF6⁺肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞在基因表达上更接近慢性感染的 T_SL 细胞。 这些cluster在三维 PHATE 嵌入中的放置证实了来自慢性感染的 T_SL（cluster 5，棕色）和 dLN（cluster 4，紫色）中的 T_SL 之间的接近。

两个 T_EX cluster主要由来自慢性感染（cluster 11）和早期/晚期肿瘤（cluster 3）的细胞组成。cluster 11 和cluster 3 共享许多衰竭特征基因的高表达，表明来自肿瘤的 TCF1^-PD-1^hi Tim3⁺ 肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞与慢性 LCMV 感染中的 T_EX 细胞相似。然而，与来自慢性 LCMV（cluster 11）的 T_EX 相比，来自肿瘤（cluster 3）的 T_EX 具有更高的效应分子转录物（Ifng、Tnfa 和 Il2）表达。这两个迁移细胞cluster主要由来自慢性感染的细胞（clsuter 1 和 8）支配，这证实了 dLN 或肿瘤中很少有肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞具有这种独特的基因表达模式。cluster 6（我们根据高 Tcf7 表达将其归类为 T_SL cluster）增加了许多迁移特征基因的表达，这可能表明在我们的肿瘤模型中，cluster 6 与该群体最接近。总之，这些数据表明肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞群是从 T_SL 到 T_EX 的细胞的异质混合物，并表明终末分化可能在空间上受到调节。

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dLN T_SL cells are distinct from memory CD8⁺ T cells

T_SL 细胞与记忆 T (T_mem) 细胞共享一些特征，因此我们旨在直接测试 dLN 中鉴定的 T_SL 群体是否与经典 T_mem 不同。 我们比较了来自早期和晚期 dLN 的 GP33⁺ CD8⁺ T 细胞与急性 LCMV 感染 28 天后从小鼠脾脏中分选的 GP33⁺ CD8⁺ T 细胞的转录组。 编码来自急性感染的 CD8⁺ T 细胞的cluster与编码 dLN T 细胞的cluster不重叠。 此外，CCL5 和 Ly6c2 是急性 LCMV 和早期 dLN 细胞中差异表达最高的基因之一。 这些基因分别与 Tmem 细胞的维持和归巢有关。 相比之下，T_mem 细胞的祖细胞和衰竭相关基因的表达较低。 总之，这些数据证实 dLN 中的肿瘤特异性 T_SL 细胞在转录上与急性感染后形成的典型 T_mem 不同。

Progressive differentiation of CD8⁺ T cells occurs over time in tumors but not dLNs

为了可视化 CD8⁺ T 细胞分化是否在空间或时间水平上受到调节，我们将来自 GP33 特异性 CD8⁺ T 细胞在早期或晚期时间点成对嵌入肿瘤或 dLN 中的表达数据，并使用 PHATE 可视化它们的异同。单细胞可视化方法试图在低维中嵌入细胞之间的关系。尽管一些单细胞可视化方法仅捕获细胞之间的局部相似性或差异[例如均匀流形近似投影 (UMAP) 或 t 分布随机邻域嵌入 (tSNE)]，但其他方法同时捕获局部和全局距离（扩散图和 PHATE） .由于 PHATE 捕获局部和全局距离，因此这种方法能够准确地可视化沿潜在稀疏采样路径的细胞状态之间的转换；因此，PHATE 是发生在连续分化分布中的发育过程的理想选择。在每个 PHATE 共嵌入中，我们确定了原型 naïve (Ccr7⁺ Sell⁺ Lef⁺)、T_SL (Tcf7⁺ Xcl1⁺ Slamf6⁺) 和 T_EX (Pdcd1⁺ Havcr2⁺ Cd101⁺) 细胞在嵌入图上的位置。这允许更容易地可视化这些微分状态之间的转换。为了对我们的 PHATE 嵌入的转换进行无偏分析，我们执行了伪时间分析并利用了 scVelo，这是一种经过优化的工具，可以使用来自表达数据的转录剪接动力学来推断分化轨迹。根据它们从 0 到 1 的伪时间值，在每个 PHATE 嵌入中对细胞进行伪着色，并且相关的直方图显示了作为伪时间函数的相对细胞分布频率。提取了来自 scVelo 在共嵌入肿瘤样本上的细胞的伪时间排序，并估计了从 T_SL 到 T_EX 的发育轨迹。这些无偏见的分析支持这样一种观点，即在每个嵌入中，分化的方向都从朴素到 T_SL 再到 T_EX。这使我们能够通过评估来自每个样本的细胞在 PHATE 嵌入中的相对位置来确定肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞分化是如何调节的。

下图显示了肿瘤和 dLN 中 T 细胞分化的时间调控。在肿瘤 PHATE 嵌入中，观察到不同的初始细胞和 T_EX 细胞，但难以识别原型 T_SL 细胞，这与这些细胞可能不在我们模型中的肿瘤中的想法一致。 T_EX 样细胞的优势来自晚期肿瘤，而早期肿瘤包含越来越少和越来越分化的 CD8⁺ T 细胞的混合物。因此，随着肿瘤的发展，我们观察到肿瘤特异性 T 细胞群向更加终末分化的状态发展。这与 TME 在早期肿瘤和晚期肿瘤之间从 T 细胞发炎到非 T 细胞发炎的总体转变相对应。在 dLN 中，确定了不同的原始细胞和 T_SL 细胞，但更难以辨别原型 T_EX 群体。与肿瘤相反，来自早期和晚期 dLN 的细胞分布在很大程度上是重叠的。同样，scVelo 分析证实早期和晚期 dLN 的细胞之间没有一致的分化方向。来自 dLN 的 T 细胞在早期和晚期时间点也显示出类似的伪时间分布。早期和晚期 dLN 样本之间的相似性值得注意，因为它们是从肿瘤发展不同阶段的动物中分离出来的，它们的稳定性与 TME 中 T 细胞中观察到的变化形成鲜明对比。总之，这些数据表明，在肿瘤发展过程中，dLN 中的大多数肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞保持稳定、分化程度较低的状态，而肿瘤中的 T 细胞逐渐分化为终末期。

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A continuum of differentiation defines the transition of tumor-specific CD8⁺ T cells from dLNs to tumor(空间位置）

分析了空间位置（dLN 与肿瘤）如何影响肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞分化。在早期和晚期小鼠中，我们在两个时间点都观察到了不同的初始、T_SL 和 T^EX 细胞，并且伪时间和 scVelo 分析支持从原型 T_SL 到原型 T_EX 细胞的连续分化轨迹。在这两个时间点，细胞与 dLN 和肿瘤明显分离，分化程度较低的 T 细胞主要来自 dLN，而分化程度较高的 T 细胞主要来自肿瘤。在极端情况下，两个部位的细胞平滑过渡，并且从 dLN 到肿瘤的速度模式很强。转录动力学表明 dLN 内的假定分化运动向在肿瘤中观察到的分化程度更高的状态移动，这可能是由细胞从 dLN 迁移到肿瘤所驱动的。伪时间分析支持这一结论，因为 dLN 和肿瘤 T 细胞分别在早期和晚期伪时间（分别为 0 和 1）富集，且分布更均匀。这提供了一种方法来可视化初始相关、祖细胞相关、迁移相关、耗竭相关、效应分子和转录因子基因的表达如何随着细胞在早期和晚期荷瘤小鼠中的分化而发生变化。随着伪时间的进展（0到1），祖细胞相关基因减少，迁移相关、耗竭相关和效应分子基因增加。此外，对与 TCR 信号相关的基因的分析，如 Nr4a1、Nr4a2、Nr4a3、Egr1、Atf3、Vps37b 和 Fosb，也显示了整个伪时间的明显增加。
TCR 信号被认为驱动 CD8⁺ T 细胞反应的终末分化。 为了更好地可视化哪些 T 细胞正在接收 TCR 信号，我们根据 Nr4a1 (Nur77) 表达对 8 周和 17 周的 PHATE 共嵌入进行了伪彩色，这是一种常用的 TCR 信号指标。 Nr4a1 在分化程度更高的细胞（在肿瘤中）增加，而 T_SL 细胞的 Nr4a1 表达水平与 TN 细胞相似。 这些结果与我们之前对来自 dLN 和肿瘤（注意 TCR 信号基因）的 T_SL 和 T_EX cluster的分析一致，并表明 TCR 信号的空间调节。

The dLN maintains a reservoir of tumor-specific T_SL cells

尽管上述轨迹分析表明 dLN CD8⁺ T 细胞在肿瘤中分化为 CD8⁺ T 细胞，但肿瘤中的 T 细胞仍可能与 dLN 中的 T 细胞无关。为了评估 dLN 和肿瘤 T 细胞之间的谱系关系，我们确定了具有独特和共享 TCR 序列的 T 细胞克隆。然后我们评估了早期 dLN 和早期肿瘤以及晚期 dLN 和晚期肿瘤之间是否存在共享克隆（两个或多个具有相同 TCRα 和 TCRβ 对的细胞）。在早期和晚期时间点，dLN 和肿瘤中的 GP33 特异性 CD8⁺ T 细胞之间存在大量克隆重叠。此外，dLN 中单个克隆的频率与肿瘤之间存在良好的相关性。肿瘤中共享 TCR 序列的克隆多样性随着时间的推移没有太大变化（Simpsons D = 0.028 早期与 0.024 晚期），但相比之下，早期 dLN 中的 TCR 克隆多样性从第 8 周到第 17 周下降（Simpsons D = 0.009 早期与0.037 晚）。此外，Morisita-Horn 指数在每个时间点显示 dLN 和肿瘤之间的高度相似性，但不同时间点的组织之间几乎没有相似性。对 dLN 和肿瘤中前三个克隆的分析表明，它们分布在整个分化轨迹中，并以多种分化状态和位置存在。此外，这些克隆细胞的假时间值增加并在肿瘤中达到峰值。

它们转录状态的稳定性以及分化程度较低的 T_SL 细胞中早期和晚期 dLN T 细胞的富集提出了一个问题，即 dLN 中肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞的克隆是否在肿瘤发展过程中得以维持。 纵隔 LN（肿瘤引流）中 T 细胞的分析需要对动物进行安乐死，因此我们无法直接比较早期和晚期时间点之间的 T 细胞克隆。 因此，我们使用了为响应共同抗原的多克隆群体定义共同 TCR motif的算法，并分析了来自早期和晚期 dLN 和肿瘤的 GP33 特异性 CD8⁺ T 细胞。 我们总共鉴定了 20 个 TCRα 基序和 12 个 TCRβ motif，并发现 dLN 中 TCR 基序的存在与同一小鼠的肿瘤之间存在良好的一致性。 这些数据有力地支持了以下假设：dLN（可能还有肿瘤）中的大多数肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞在肿瘤发展过程中得以维持(这部分是我们关注的重点)。

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Migration from the dLN maintains TCF1 expression by the intratumoral T cell pool

我们的数据支持在肿瘤中维持 T 细胞的两种非互斥模型：(i) 肿瘤中的肿瘤特异性 TCF1⁺ CD8⁺ T 细胞可能是一个自我维持的群体，它继续增殖和分化以维持 T 细胞反应 肿瘤，或 (ii) 肿瘤中 TCF1⁺ T 细胞的维持可能是由于少量肿瘤特异性 T_SL 从 dLN 的持续迁移。 T_SL 从 dLN 以外的组织迁移是不可能的，因为在所有其他检查的组织（脾、胸腺、骨髓、腹股沟和肠系膜 LN）中都不存在 GP33 特异性 T_SL 群。

为了验证后一个假设，我们用 FTY720 治疗 KP-NINJA 荷瘤小鼠以阻止淋巴细胞迁移。肿瘤在 KP-NINJA 小鼠中通过气管内感染 2.5 × 10⁷ Ad5mSPC-Cre 的斑块形成单位 (PFU) 和如前所述的多西环素和他莫昔芬给药，然后在注射后 6 至 9 周内用 FTY720 或载体治疗. 在 FTY720 治疗 3 周后，与载体治疗的对照相比，肿瘤组织中 GP33 特异性 TCF1⁺CD8⁺T 细胞而非 TCF1^-CD8⁺T 细胞的频率和数量减少。这表示这些细胞的数量下降了约 4 倍（从 1216 ± 258 到 335 ± 78）。相比之下，dLN 中 TCF1⁺ CD8⁺ T 细胞的数量不受 FTY720 处理的影响，表明观察到的减少可能是由于阻断迁移的影响，而不是 FTY720 对 TCF1⁺ CD8⁺T 细胞的直接影响。观察到的肿瘤中 TCF1⁺ CD8⁺ T 细胞的四倍下降比肿瘤中同期 GP33 特异性 CD8⁺ T 细胞总数的两倍下降（从 10,488 ± 2003 到 5506 ± 1392）更为急剧，表明TCF1⁺ T 细胞群受迁移阻断的影响更大。在肿瘤中的 GP33^-CD8⁺T 细胞群中观察到类似的减少。因此，这些结果与肿瘤特异性 T_SL 细胞从 dLN 的迁移是维持肿瘤中抗肿瘤 T 细胞 TCF1 表达所必需的假设一致。

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T_SL-like populations are present in metastatic and nonmetastatic LNs of patients with lung cancer

来自人类患者的 dLN 通常用于诊断目的，因此很难获得用于研究。 因此，为了研究 dLN T 细胞在人类 LUAD 中的潜在重要性，我们利用了最近发表的单细胞 RNA-seq 数据集，该数据集来自一项研究，其中包括正常肺组织 (nLung)、含肿瘤的肺组织 (tLung)、 通过手术切除或超声引导下的支气管镜活检从 44 名初治 LUAD 患者 (GSE131907) 收集的转移性淋巴结 (mLN) 和非转移性肺引流淋巴结 (nLN)。 我们根据之前的注释对来自所有四种组织的 10,046 个 CD8⁺ T 细胞进行了cataloged ，并将它们分为 15 个cluster并使用降维方法 UMAP 进行可视化。
使用前面使用的相同特征基因，我们将来自 LUAD 患者的 CD8⁺ T 细胞cluster分为 T_N 细胞样、T_SL 样、迁移性 T 细胞 (T_MIG) 样和 T_EX 样类别。我们确定了一个原始cluster（cluster 1）、四个具有类似 T_SL 特征的cluster（cluster 14、0、8 和 2；从高到低的 TCF7 表达排序），五个具有类似 T_MIG 特征的cluster（cluster 11、 3、9、12 和 5；从最高到最低的 KLRG1 表达排序），以及具有类似 T_EX 特征的四个cluster（cluster 4、7、10 和 1；从最高到最低的 PDCD1 表达排序）。在我们的模型中，T_SL 样和 T_EX 样cluster的基因表达特征与来自荷瘤 KP-NINJA 小鼠的这些群体显着相似。 73% 的 nLN CD8⁺ T 细胞是 T_SL 样的，与我们在小鼠中的发现一致。 T_SL 样细胞分别占来自 tLung 的 CD8⁺ T 细胞的 31%，仅占来自 mLN 和 nLung 的 CD8⁺ T 细胞的 9% 和 15%。相比之下，类 T_EX 细胞cluster在 mLN 和 tLung 中占主导地位（分别为 61% 和 61%）。 nLung 组织包含的细胞主要属于 T_MIG 样cluster (78%)。总之，来自 LUAD 患者的这些数据支持我们的假设，即 T_SL 细胞驻留在 dLN 中，并且在 dLN T 细胞迁移到肿瘤后发生分化。

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DISCUSSION

TCF1⁺PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞存在于人和鼠肿瘤中，是维持抗肿瘤 T 细胞反应和免疫治疗后反应所必需的，但其维持机制尚不清楚。使用 LUAD 的本地模型，我们发现瘤内 TCF1⁺PD-1⁺CD8⁺T 细胞群是通过从 dLN 迁移来维持的。 dLN 中的大多数肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞表达 PD-1、TCF1 和 SLAMF6，并且具有与慢性 LCMV 感染期间观察到的典型 T_SL 细胞更相似的转录模式。相比之下，虽然一些瘤内 CD8⁺ T 细胞是 PD-1⁺ 和 TCF1⁺，但许多不表达 SLAMF6 或其他与 T_SL 细胞相关的基因。此外，随着 TME 从热转变为冷，肿瘤内 T 细胞群变得更加分化，而 dLN 中的细胞群在转录和表型水平上没有变化。这些发现与在组织和伪时间分析之间发现的共享 TCR 序列相结合，提供了令人信服的证据，即 dLN 中的肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞在发育上与更分化的瘤内 T 细胞相关（并且可能是其发育前体）。早期和晚期肿瘤。未来的研究将需要直接测试这一点。尽管大多数抗肿瘤 CD8⁺ T 细胞功能和分化的研究都集中在肿瘤组织上，但我们的数据表明，肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞的分化过程始于 dLN，dLN 作为维持 T 细胞在在整个肿瘤发展过程中呈茎状状态。

冷肿瘤患者是否可以对免疫治疗干预产生反应的问题仍然不确定。冷肿瘤具有较差的 T 细胞浸润和/或 T 细胞排斥，这被认为反映了抗肿瘤免疫反应减弱或缺失，这与其对检查点疗法的不良反应一致。然而，冷肿瘤与热肿瘤具有相似的突变负荷和抗原呈递能力，这表明它们都具有启动和驱动抗肿瘤 T 细胞反应的能力。这些发现与我们模型中的冷肿瘤一致，它们维持了新抗原的表达和新抗原的体内呈递。鉴于这些观察结果，我们假设冷 TME 是整个宿主中肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞全面耗尽的结果。出乎意料的是，晚期肿瘤中的许多肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞是 TCF1⁺，尽管伪时间分析表明这些 T 细胞比早期肿瘤的 T 细胞分化程度更高。这些数据与肿瘤内 T 细胞分化状态增加可以解释晚期肿瘤的冷表型的可能性一致。其他可能性包括迁移 T 细胞无法物理进入肿瘤或树突状细胞 (DC) 迁移或功能缺陷。我们还发现，冷 TME 并不表示肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞的全面衰竭，因为冷肿瘤与含有 T_SL 细胞的 dLN 相关，这些 T_SL 细胞与热肿瘤相关的 dLN 中的 T_SL 细胞在转录上相似。因此，dLN T_SL 细胞的远端位置可能保护它们免受肿瘤发展过程中 TME 内发生的变化。
尽管许多信号可以促进瘤内 CD8⁺ T 细胞的分化，但 TCR 信号是主要候选者。 TCR 信号在慢性感染中驱动终末 T 细胞分化，识别更多抗原的 CD8⁺ T 细胞会遭受更严重的衰竭。同样，传递较弱 TCR 信号的抗原肽是 T 细胞耗竭的较弱驱动因素。在慢性感染期间，Tcf7 是维持 CD8⁺ T 细胞所必需的，但 TCR 和炎症信号会促进 TCF1 下调。我们发现肿瘤内 T 细胞具有与下游 TCR 信号相关的高水平转录物，而 dLN T 细胞具有这些转录物的低表达。这些数据与 dLN 可以保护 T_SL 细胞免受持续抗原暴露的想法一致。我们假设瘤内 CD8⁺ T 细胞无法逃避持久性抗原，并且如果不从 dLN 迁移，肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞池将耗尽。此外，由于以更高的亲和力识别肿瘤抗原的 T 细胞克隆（所谓的“最佳拟合”克隆）更容易耗尽，因此 dLN 可能在防止最佳拟合克隆在肿瘤发展过程中丢失方面发挥重要作用.脾白髓可能在慢性 LCMV 感染期间发挥类似作用，尽管白髓和红髓都是 LCMV 克隆 13 感染的部位。我们的数据还提出了肿瘤内niche（如 T_LS）是否可以存在于肿瘤中以保护 T_SL 细胞免于分化的问题。我们之前表明，在我们的模型中与晚期肿瘤相关的 T_LS 是抗原呈递的位点，但诸如 T_LS 等肿瘤近端壁龛是否可以保护驻留 T 细胞免受持续的抗原暴露还有待观察.

我们的数据强调了迁移在维持肿瘤中 T_SL 细胞中的关键作用，但与 T 细胞在迁移前在淋巴组织中分化的观点不太一致。后者已见于慢性 LCMV 感染，可能是由于组织中的持续感染所致。相比之下，我们观察到 TCF1^hi T 细胞在肿瘤内分化，并且肿瘤中 TCF^hi T 细胞的存在需要迁移。我们不能排除来自除 dLN 之外的其他肿瘤外组织（例如脾脏或胸腺）的少量幼稚样 T 细胞可能有助于在研究的时间过程中持续进行的抗肿瘤免疫反应的可能性，因为 FTY720 治疗可能也阻止从这些组织迁移。然而，dLN 和肿瘤之间 TCR 序列的一致性表明这些贡献将是最小的。目前尚不清楚是什么驱动了 T_SL 细胞从 dLN 迁移到肿瘤。 DC 从肿瘤迁移到 dLN 对启动 T 细胞很重要，但 DC 在维持 dLN 中 T_SL 细胞中的作用尚不确定。一个简单的模型是来自迁移 DC 的周期性信号也是维持迁移 T 细胞群所必需的。关键的是，虽然我们没有看到 FTY720 处理后 dLN 中分化程度较低的 T 细胞的积累，但 FTY720 也可能阻止抗原呈递 DC 向 LN 迁移，这可能影响 dLN 中 T_SL 细胞的分化。需要进一步的研究来测试哪些信号对于 dLN 中 T 细胞的维持和迁移是必要的。

dLN 在免疫治疗中的作用仍不确定。 DCs 上 PD-L1 的表达对于某些肿瘤模型中抗 PD-L1 的反应很重要，肿瘤 dLNs 中的迁移 DCs 表达 PD-L1 和共刺激受体 B7-2。此外，PD-1 阻断剂可以在移植肿瘤模型中作用于 dLN。 PD-1 阻断是否在人类 TME 之外起作用尚不清楚，但患者抗 PD-1 治疗后的疗效与外周血中免疫细胞群的变化和肿瘤中 T 细胞克隆的出现有关之前未检测到的治疗后。我们对人类 CD8⁺ T 细胞的分析表明，淋巴结和肿瘤中存在 T_SL 样细胞。然而，由于 PD-1 阻断在患有冷肿瘤的患者中功能不佳，这表明这些患者缺乏 LN T_SL 细胞，或者 PD-1 阻断不足以驱动这些患者的 LN 的治疗反应。因此，确定针对 dLN 中肿瘤特异性 T 细胞的新治疗策略可能是改善患有冷肿瘤的癌症患者预后的一种手段。

MATERIALS AND METHODS(关注一下重点方法)

Motif analysis

Consensus motifs in grouped CDR3 amino acid sequences were identified using two motif-based sequencing analysis tools: Multiple Em for Motif Elicitation and Gapped Local Alignment of Motifs (GLAM2). The motif analysis across all four samples (early and late dLN and tumor) was performed separately for TCRα and TCRβ chain, including clones with ≥2 cells only. At first, fasta files were created separately, including TCRα or TCRβ CDR3 amino acid sequences for the clones with ≥2 cells, using Biostrings package. These fasta files were used as input files for motif analysis, separately for each chain. Filtration of CDR3 amino acid sequences were performed on the basis of low alignment scores by GLAM2. From there, CDR3 amino acid sequences for each chain were further subgrouped into separate fasta files based on similarity in sequences and alignment scores. Each subgroup of sequences for each chain were run for motif analysis using GLAM2 function and a position weight matrix as an output to define the motif for each subgroup of sequences, either for TCRα or β chain. The contribution of clones from each of the four samples to each motif (either for TCRα or TCRβ chain) was traced back using the clone IDs. After this, consensus motif for each chain was defined as having clones shared by all four samples and ranked in an order based on the number of clones, giving rise to each motif。

Human CD8⁺ T cell single-cell RNAseq analysis

Single-cell data were obtained from the Gene Expression Omnibus (GEO) by accession code GSE131907. Data processing, analysis, and visualization were conducted using R program with package Seurat (version 3.1.0). Only CD8⁺ T cells (original labels “CD8 low T,” “Cytotoxic CD8⁺ T,” “Naïve CD8⁺ T,” and “Exhausted CD8⁺ T”) with tissues from tumor or normal lungs and metastatic or normal LNs (original labels “tLung,” “nLung,” “mLN,” and “nLN”) were used for the analysis. Raw gene counts were log normalized by Seurat function NormalizeData with the parameter normalization.method set to “LogNormalize.” Cell clusters were identified from the normalized data using functions FindNeighbors and FindClusters on top 20 PCs and resolution 0.75. UMAP was used to visualize cell clusters based on the top 20 PCs. For the marker gene expression heatmap, relative abundances for each gene were calculated as Z-scaled average of log₂(RC + 1). Here, RC is the relative counts calculated by Seurat function NormalizeData with parameter normalization.method set to “RC.”

生活很好，有你更好