肿瘤免疫治疗是当前癌症研究领域的热点之一，而对肿瘤抗原特异性T细胞的全面分析一直是该领域中一项具有挑战性的工作。本研究中，作者通过单细胞转录组+TCR测序技术对肿瘤小鼠和黑色素瘤患者的血液和肿瘤组织进行分析，利用TCR序列作为“分子条形码”的方法为鉴定循环抗肿瘤 CD8+ T 细胞提供新的思路。
Single-cell analyses identify circulating anti-tumor CD8 T cells and markers for their enrichment
发表时间：2021.3.2（published online）
发表期刊：Journal of Experimental Medicine ; IF=11.743
实验平台：10x Genomics Chromium（5’表达文库+VDJ富集文库）、CITE-seq
样本类型和数量：５只皮下结肠腺癌模型小鼠和4位黑色素瘤患者，血液和肿瘤
DOI: 10.1084/jem.20200920
研究背景
肿瘤免疫治疗彻底改变了固体和液体肿瘤的治疗方式。新 CD8+ T 细胞从循环系统转移到肿瘤组织，即“克隆替代”，与免疫疗法更好的反应相关。但是，目前需要改进方法来鉴定针对肿瘤的T细胞，以将分析集中于少数具有预后和功能相关性的循环T细胞。
本研究中，作者使用单细胞转录组测序技术来跟踪血液中与肿瘤相关的T细胞反应。使用TCR作为“分子条形码”，使用成对的肿瘤和血液样本来识别和表征肿瘤匹配(TM)血液CD8+ T细胞，这些细胞与小鼠MC38肿瘤或患者黑色素瘤中的CD8+ T细胞具有相同的TCR序列。对检查点阻断无反应患者的两个纵向样本中，TM细胞转变并出现更强的功能障碍信号。研究者鉴定了富集TM细胞的候选表面标记，并在小鼠中使用CITE-seq验证了三种标记。重要的是，与单一标记相比，这些标记基因的联合在鉴定TM细胞上实现了更好的性能。
研究内容
1、用MC38肿瘤中匹配的CD8+ T细胞的TCR表征血液中的CD8+ T细胞
由于TCR编码抗原特异性，研究者假设TCR序列可用于评估血液中哪些克隆与抗肿瘤反应相关。为了测试这一点，从小鼠配对的血液和MC38肿瘤中分离出的CD8+ T细胞进行了scRNAseq和TCR测序。通过对鉴定到的细胞分析发现，肿瘤中CD8+ T细胞多样性高。
为了评估肿瘤和血液中的克隆重叠，用TCR序列将二者的CD8+ T细胞进行匹配，并进行匹配细胞（TM）与非匹配细胞（非TM）的差异基因和信号通路富集分析，结果显示，TM细胞富集效应器信号、免疫效应过程和淋巴细胞迁移功能，非TM细胞则富集了原始CD8+ 细胞信号功能。使用从公开数据库中筛选到的特征基因，发现TM细胞富集激活和TRM特征，而非TM细胞富集原始特征。总的来说，这些结果与TM细胞对肿瘤的积极反应一致，而且支持使用TCR来鉴定TM细胞而不是依赖单个标记物（如PD-１）。
2、通过流式细胞术发现血液中TM CD8+ T细胞的转录特征可用于鉴定富集标记
为了测试单基因的表面marker是否可以识别TM细胞成分，研究者开发了COMET计算工具来从单细胞转录组结果中预测marker基因，并鉴定到了82个候选阳性标记。并通过CITE-seq验证了CD39、CX3CR1、NKG2D三个蛋白联合比单一标记更能提高鉴定TM细胞的敏感性和特异性。因此，除了TCR，细胞表面标记物也可被用于区分TM细胞和非TM细胞。
3、血液中的TM CD8+ T细胞比肿瘤中的匹配克隆具有更低程度的功能失调
研究者接下来检测肿瘤中CD8+ T细胞（其TCR在血液中也能被检测到，即“血液匹配”细胞）的转录异质性。功能分析显示“血液匹配”细胞展现出更高水平的终末衰竭信号和TRM信号，以及更低水平的原始T细胞信号。这些发现表明，血液中的TM成分对应于肿瘤中的匹配克隆，这些克隆可能对肿瘤抗原有反应并与肿瘤杀伤相关。
接下来，研究者将血液中TM细胞的表达谱与肿瘤中的匹配克隆进行了比较并发现肿瘤内的血液匹配群体比血液中的克隆群体更具多样性，说明CD8+ T细胞在进入肿瘤时发生变异并呈现出多种状态。在群体水平和逐个克隆基础上将TM细胞与肿瘤中“血液匹配”细胞相互比较，发现TM细胞显著富集更多的类效应器特征而“血液匹配”细胞更富集末端耗竭特征。这些数据表明血液中的TM细胞的功能障碍比肿瘤中的匹配细胞弱，并且在迁移到肿瘤中后，这些细胞获得了功能障碍状态。
4. 黑色素瘤患者的血液中可以检测到活化的TM CD8+ T细胞
研究者对4名未接受过检查点治疗的晚期黑色素瘤患者的血液和肿瘤样品进行了单细胞转录组+TCR测序，使用TCR序列作为分子条形码来检测血液中的TM细胞。其中每个病人的TM细胞主要存在于非原始细胞亚群中，且占比极高。另外TM细胞和非TM的表型特征都与小鼠实验的结果一致，支持了血液中的TM细胞功能障碍可能比肿瘤中的匹配细胞弱的观点。
5. 进行抗PD-1 治疗后，患者血液纵向追踪TM CD8+ T细胞并显现出衰竭程度随时间增加
对检查点阻碍没有反应的两个病人后续得到的血液样品进行检测，发现两个病人的血液和肿瘤样品检测到重叠的TCR。且随着时间的推移，血液中的TM细胞可能会变得更加衰竭，但最终是肿瘤中的衰竭水平更高。
进一步的量化分析表明，TM组分相对于非TM组分的总体转录图谱保持高度一致性。对病人间变异性分析发现TM或非TM组分特异的个体基因转录程度具有显著相关性。若只在细胞表面marker里做这种分析也存在相关性，说明表面表达marker可被用于鉴定TM群体，它们在不同肿瘤负荷和治疗条件下都有很强的稳定性。
6. 细胞表面marker联合用于检测患者血液中的TM成分
为了找到合适的用于富集TM细胞的marker，研究者再次使用COMET。经过筛选，研究者发现了四个低表达基因LTB、CCR7、GYPC和FLT3LG，在不同肿瘤负荷和治疗条件下都有稳健的预测准确性。此外，研究者还发现两个阳性marker，KLRD1和LGALS1。为了提高这些marker从血液中分离TM细胞的性能，研究者将它们联合尝试。在所有样品中，两个或多个基因比单标记的敏感性和特异性显著提高。最后，研究者还使用GLIPH2和iSMART两个工具对TCR重新聚类，并再次验证marker的稳定性，得到了与之前相近的结果。
结论
本研究使用单细胞转录组+TCR测序方法，利用TCR序列作为分子条形码来检测和表征MC38肿瘤小鼠和黑色素瘤患者的血液中的TM CD8+ 细胞。
得到以下结果：
1. 与血液中的非匹配T细胞相比，TM细胞具有更强的活化作用，而且与肿瘤中相匹配的细胞相比有更低的耗竭性。
2. 已经被用于识别循环抗肿瘤CD8+ T细胞的PD-1，识别TM细胞时敏感性较差。
3. 在小鼠和患者中确定了TM细胞的候选细胞表面marker，并在小鼠中证实了其中的NKG2D、CD39和CX3CR1。
这些数据结果表明，TCR可用于鉴定与肿瘤相关的细胞，揭示TM细胞独特的转录特性，以及开发用于追踪和分析这些细胞的marker panel。
参考文献
Pauken, Kristen E et al. “Single-cell analyses identify circulating anti-tumor CD8 T cells and markers for their enrichment.” The Journal of experimental medicine vol. 218,4 (2021): e20200920.
