1. Author
Patrick C.Wilson毕业于德克萨斯大学西南医学中心，后续在纽约洛克菲勒大学Michel Nussenzweig实验室接受了博士后培训。Patrick主要关注B细胞生物学、抗体库表征以及从单个人类B细胞产生单克隆抗体的开发上。Patrick还关注人类B细胞和抗体对流感的反应，例如在感染与疫苗接种期间，临床试验中对新型流感疫苗的反应，或从年轻到年老的不同年龄组对流感疫苗或感染的反应。
2. Background
季节性疫苗在很大程度上驱动了针对血凝素（HA）头域的抗体反应。而不是针对保守的stalk结构域的抗体。下一代疫苗旨在通过靶向保守的表位来产生对多种流感病毒亚型的持久和广泛的保护性免疫。目前比较理想的疫苗策略是嵌合HA（cHA），其stalk衍生自2009年大流行H1N1，头部是来自禽类的A型流感亚型。头部的免疫原性对于人类来说为初始的。有研究表明这种疫苗可以诱导产生大量的保守的广谱并且拥有很好的保护效果。
在一期临床实验中发现，含有角鲨烯佐剂（AS03）的cHA疫苗可以诱导ASCs何茎部靶向的血清抗体反应。接种cHA的个体血清具有广泛的结合活性，通过茎特异性抗体反应抑制神经氨酸酶，ADCC活性。同时就免疫策略而言，灭活＋AS03的连续两次免疫可以诱导最持久的血清抗体反应。
3. Methods
单克隆抗体制造
病毒与重组蛋白的表达
ELISA
中和实验
抗体依赖的细胞毒性作用（ADCC）
ELISpot 实验
生物膜衍射技术
单细胞RNA测序与分析
谱系与克隆分析
抗体结合印记谱
4. Results
4.1 cH5/1+ B细胞的scrna序列揭示了不同的转录亚群
为了研究接种cHA疫苗后B细胞组成情况，实验团队在多个时间点用不同的cHA疫苗策略免疫，检测了各组得B细胞分群情况。cH8/1N1诱导后7天和cH5/1N1增强后第92天。并从CD19+CD27++CD38++ASCs含量大于0.5%的个体中分离PBs，并进行单BCR扩增和克隆。PB群富含激活的MBCs，具有很强的病毒特异性。灭活苗+AS03的在cH8/1N1和cH5/1N1免疫后能够强烈诱导cHA特异性的PBs。实验团队利用基因集富集分析(GSEA)将这6个细胞群的基因表达模式与不同B细胞亚群的基因表达模式进行了比较，包括幼稚B细胞(NBCs)、静止B细胞(RMBCs)、非典型B细胞(atMBCs)、活化B细胞(ABC)、ASCs。第3群富集了NBC，而第2群对任何中群没有富集，因为它们在很大程度是转录静止的。此外，1、4、5和6群在不同的轨迹上都表现出ABC的特征，1、4和6群富含与ASCs相关的基因。5群高表达atMBCs相关的基因。此外，4、5和6群中的细胞表达高水平的主要组织相容性复合体II类(MHC II类)分子，表明最近与CD4+T细胞和潜在的生发中心(GC)迁移有同源相互作用。综上所述，这些数据表明5群类似于CD21lo群和atMBCs，而4和6群分别是潜在的GC迁移者，为MBC和ASC分化做准备。最后，来自灭活苗+AS03组的cHA结合B细胞更可能成为ABC群(1,4,5和6)中的细胞，而仅IIV组的静止B细胞群的B细胞丰富。此外，第1组和第2组中ABC群的富集与血清抗体滴度ASC反应一致，这表明接受IIV+AS03的供体具有卓越的B细胞活化。
4.2 cH5/1+ B细胞簇表现出不同的抗体同型和体细胞超突变谱
通过转录组水平聚类分析了B细胞分群后，接下来实验团队试图确定这些B细胞群是否与不同的抗体类别转化和体细胞超突变谱相关。3群的B细胞主要以IgM和IgD为主，但突变频率低。相比之下，其他群的细胞很大程度转换为IgG亚型。
4.3 cH5/1+特异记忆B细胞和cHA诱导浆细胞的谱系表征
Stalk特异性的抗体通常由经典的IgV基因编码。由于人类对禽类的H5头部没有预存的免疫力，因此在113天分选得到的B细胞很有可能是靶向Stalk结构域的。通过重轻链配对分析，发现cH5/1的B细胞库呈现多样性。Stalk富集了VH1-69+Kappa；靶向HA的anchor位点富集了VH3-23/3-30/3-48+ VK3-11/3-15；靶向HA三聚体界面头部的VH4+VK1-39。相比于独特克隆型，靶向于Stalk克隆扩增的克隆型中VH1-69+Kappa被显著富集。MBCs和PBs之间共享的多个克隆是公共克隆，表明cHA疫苗接种导致参与者在多个时间点的限制性B细胞趋同。对最大的私有克隆和最大的公共克隆的分析显示，克隆型在多个转录集群中都有代表，特别是与激活记忆和ASC相关群1、4和5。这些数据表明，接种cHA疫苗可以激活和扩增克隆。总之，cHA疫苗激活并导致B细胞针对HA茎结构域的保守表位扩增。
4.3 体细胞超突变的cH5/1+ B细胞主要靶向stalk区域
为了进一步探索boost28天后的cH5/1 B细胞的表位特异性，实验团队合成了175个单克隆抗体，占据之前scRNA-seq分析的所有B细胞的10%。其中群3中特异性抗体合成最多，在转录分析上这群细胞与NBC相似。接下来实验团队聚焦在体细胞超突变的cH5/1+单克隆抗体上。将V基因上突变＞2的定义为经历过体细胞突变。发现74%的单克隆抗体靶向于Stalk，而8%靶向于头部结构域。另一方面，实验团队通过竞争实验检测抗体是否与central stalk（CR9114）、anchor（222-1C064）、HA头部三聚体界面（FluA-20）竞争。在与Stalk结合的单克隆抗体中，44%靶向anchor，22%靶向central stalk的。各疫苗组特异性B细胞的比例也不相同，其中1组（LAIV/IIV+AS03）富集更多的anchor和central stalk单克隆抗体。除此以外，记忆B细胞根据特异性的不同分为几个群。其中stalk靶向的B细胞富集在群1（ASC/ABC），头部靶向的B细胞富集在群5（atMBC），靶向未知H1表位的B细胞富集在群2。同时实验团队发现针对anchor表位的几个B细胞克隆扩增，包括了另一项研究中季节性疫苗诱导的PB克隆扩增。HA anchor克隆成员跨越多个转录簇，提示该该克隆被cHA激活。这些数据表明，cHA疫苗可以诱导B细胞对抗多种表位，包括广泛保护的central stalk、HA anchor和HA头三聚体界面表位。
4.4 H1+ B细胞的结合和中和能力
能够结合California-09 H1的单克隆抗体中有61%的单抗可以中和该类病毒。而靶向于stalk的中和抗体中，90%为central stalk靶向的。此外，100%靶向anchor和central stalk表位的单克隆抗体为中和抗体。单克隆抗体对未知stalk表位的中和效力相对于对anchor和中central stalk表位的中和效力显著降低。结合在cH8/1和H1的浆细胞来源单克隆抗体中，只有30%为中和抗体。从PBs和MBC中分离的中和性和非中和性单克隆抗体的谱相似。结合转录组数据分析B细胞抗体的中和情况，发现70%的单克隆抗体是从激活的记忆样群1、4、5中分离出来的。2群中的单克隆抗体只有三分之一。疫苗组1(LAIV/IIV + AS03)相比于其他两个组具有更大比例的单克隆抗体。由于第一组的B细胞转录组分析发现富集了ABC簇，表明IIV+AS03这种免疫策略驱动了更大的体细胞突变并且具有更多的中和抗体。同时，靶向central stalk的单克隆抗体都具有ADCC活性，而靶向HA stalk未知表位的抗体则没有。
4.5 cHA疫苗可诱导持久的stalk靶向MBCs
之前数据表明，用IIV +AS03佐剂接种cHA可促进针对HA头部和stalk广谱保护性表位的PB和MBC应答。第4组接种了cH8/1 IIV + AS03，并增强了cH5/1 + AS03，在免疫后至少420天诱导了持久的stalk特异性血清抗体滴度。后续确定了cHA IIV+AS03疫苗重塑针对H1得B细胞库并诱导持久的stalk特异性MBCs。对接种后420天的个体中获得了14126个B细胞转录组和BCR。对接种2020-2021年季节性流感疫苗182天后，使用相同的方法产生7,119个单细胞的数据。群2、4、5和9富含与ABC相关的基因；群2、4、5、8和9富集ASC样基因；群9富集atBC相关基因；0群富集NBC样基因。并且通过与季节性流感接种者相比，cHA疫苗能够引起持久的特异性Stalk特异性MBCs。
5. Discussion
作者：Jenna J. Guthmiller
通讯作者：Patrick C.Wilson
单位：Department of Medicine,Section of Rheumatology, University of Chicago
年份：2025.4.8
期刊：Immunity
科学问题 ：cHA疫苗接种诱导的B细胞亚群和抗体谱情况，对MBC的长期影响。
讨论：研究聚焦于添加了基于角鲨烯的佐剂（AS03）的cHA灭活疫苗。通过单细胞RNA测序和B细胞受体库测序，作者对疫苗接种诱导的B细胞的特异性、功能和亚群进行了表征。他们发现，该疫苗能强力诱导针对HA茎干结构域中两个广泛中和表位的活化B细胞和记忆B细胞（MBC）。这表明该疫苗有效地靶向了病毒的保守区域，这些区域不易发生抗原漂移。
对 B 细胞反应的分析揭示了急性浆母细胞（PB）和MBC之间的克隆重叠，这表明B细胞趋同于这些具有广泛保护作用的表位。这种趋同是有效免疫反应的关键特征，因为它能使机体对病毒发起更协调、更有效的攻击。通过靶向保守表位，cHA疫苗或许能够克服传统季节性疫苗的局限性，传统季节性疫苗通常依赖于靶向可变表位，而这些可变表位会因抗原漂移而迅速变化。
免疫接种一年后，作者观察到cHA疫苗接种重塑了HA特异性MBC库，使其富含结合茎干的B细胞。这一发现意义重大，因为它证明了疫苗诱导的免疫反应具有长期持久性。结合茎干的B细胞比例增加，表明该疫苗能够针对流感病毒产生更强有力且持久的免疫力。在出现大流行威胁的背景下，这一点尤为重要，因为快速有效的免疫反应对于预防病毒传播至关重要。
此外，该研究还识别出cHA疫苗接种后B细胞的不同转录亚群。这些亚群与不同的抗体同种型和体细胞超突变谱相关，为B细胞反应的成熟和多样化提供了见解。例如，一些亚群富含与活化B细胞和抗体分泌细胞相关的基因，而其他亚群则类似于未成熟或非典型MBC。了解这些亚群对于优化疫苗设计和提高流感疫苗的有效性至关重要。
除了B细胞亚群，研究人员还对cHA诱导的PB和MBC的库特征进行了表征。他们发现，抗cHA的B细胞库高度多样化，但明显富集了针对保守表位（如中央茎干和HA锚定区域）的B细胞。这种多样性可能有助于疫苗诱导的抗体产生广泛的反应性，使其能够识别和中和多种流感病毒株。
