一、电转的简介：

电穿孔转染，作为物理方法的一种，不仅能将DNA、RNA，还能将抗体、酶及其他生物活性分子转入细菌、酵母、动物细胞和植物细胞。它是一种高效、简便的基因转移系统，具有其他转移方法无法比拟的优越性：

如操作简便、快捷，可重复性强，转染率高，适用广谱等，在面对公认难转的悬浮培养细胞中，此方法也能获得较高的转染率转染。

二、电转染原理：

电穿孔法：就是通过电场作用于细胞几微妙到几毫秒之后，在细胞膜上暂时形成小孔或开口，把大分子例如DNA等导入细胞并最终进入到细胞核中的技术。

简单来说：第一步在电击的过程中，细胞膜上出现穿孔，质粒在电泳力的作用下与细胞膜接触，并且在细胞膜上电穿孔的区域形成一种可转移的复合物。再次电击后，质粒脱离复合物并扩散到细胞质内部，开始瞬时转染，同时小部分质粒进入核内与染色体整合，开始稳定转染。一旦DNA扩散至细胞，膜上小孔会关闭

三、电穿孔转染条件的选择

1、电场参数

电场是电转染的重要因素，细胞在电场的作用下，膜通透性增加或是形成小孔，以完成转染过程。

因此电场强度是应该被优化的主要参数。此外，电场的强度不能太高，不然会增加细胞的死亡率，相对的液不能太低，这样就不能增加膜的通透性难在膜上形成小孔，因此，一个适宜的电场强度尤其重要。

不同细胞系有着不同的最佳场强值，其确定方法除了实验直接测定比较不同场强下转染率的高低外，还可以采取较为简便的间接法。

(附：存活率在50%左右的电场参数为理想参数，所以可以间接测定存活率来确定最佳电场强值。）

2、脉冲过程

①脉冲波形

脉冲波形主要分为两种：一种为方波脉冲；另一种为指数递减波脉冲。

方波脉冲是指：电压瞬间升至预设电压，保持电压放电，然后瞬间终止放电。

一般哺乳动物细胞电转染时选择方波脉冲，有较高的转染效率和细胞存活率。

指数递减波脉冲是指：先对电容充电，然后让电容完全放电，其电压变化呈指数递减。一般这种波形的脉冲电转染适用于细菌、酵母菌、昆虫细胞。

②脉冲时间

脉冲时间的选定主要取决与脉冲波形。在方波脉冲中，脉冲时间可直接设定。在指数递减波脉冲中，脉冲时间是指电压衰减至初始电压1/3时所用的时间，等于电容（C）与电阻（R）的乘积，单位是ms。在参数优化中，增加电压应当降低脉冲时间，而减小电压则应当增大脉冲时间。

③脉冲次数

一般而言，对于大多数细胞类型都选择单词脉冲。而在有些情况下可能会用到多次脉冲，因为低电压、短脉冲时间、多次脉冲可有效避免细胞损伤。多次脉冲建议中间间隔1min。

3、细胞因素

用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内，传代后2d）。因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛，表面结构致密比稳定期的细胞差，电转后，细胞膜的恢复能力强，而且处于有丝分裂期的细胞更容易接受外源DNA.细胞悬液浓度一般为1﹡106/ml，当细胞生长密度大于3﹡106/ml，转染效率会下降。原因除了细胞老化外，细胞过密会使相邻细胞相互作用增大，甚至使细胞相互融合，从而导致电场的局部微扰，使电场环境无法均一化，细胞体积越大对电击越敏感，所需电场强度也越小。

4、质粒因素

从质粒浓度看，细胞密度为1*106/ml，DNA用量在2-5ug/ml转染效率最高。转染率在一定范围内随质粒浓度的上升呈线性增高，但是到达一个峰值后，随DNA用量增加而转染率逐渐下降，其原因可能为细胞吸纳DNA有一个饱和度，过量便会产生毒性，使存活率降低，不利于转染率提高。

进行小分子量的分子转染时（siRNA/miRNA），应使用高电压、短脉冲时间。大分子量分子转染时（DNA），应使用低电压，长脉冲时间。

从质粒的纯度看，用高纯度的DNA才 能提高电转的效率，且应注意以下几点：

首先DNA／RNA应该超纯(A260／A280>1．8)，其次应不含内毒素，同时质粒应溶于双蒸水而不是TE缓冲溶液。

5、温度

一般情况下，电转的过程是在室温下进行，但在电击前后可对细胞进行冰浴处理。电击前冰浴的时间对转染率影响不大，但低温环境能够防止DNA被外源性DNA酶降解，并限制在电击中因Joule作用而产生的不良反应，因此，实验一般选择电击前冰浴5min。电击后冰浴，会影响DNA摄入，因为电击后冰浴可增强细胞收缩，细胞膜上的 电穿孔封闭较慢，延长外源性DNA摄入时间，从而提高其摄入量。在室温环境下，虽然细胞膜上的孔 封闭速度快，但在随后2h，质粒还可通过电内化进入细胞，因此摄人量不一定比4℃环境下低。而且，室温下细胞在5 min内即闭孔，在4℃的环境下穿孔状态可保持4h，穿孔封闭缓慢降低了存活率，同时细胞在低温下更容易受到损伤。

因此，综合考虑摄人量和存活率，大部分倾向于电击后细胞仍在室温或37℃下保存。

6、电转染试剂的选择

电击会对细胞造成一定程度的伤害，在转染试剂的选择上要注意，应选择具有细胞膜修复成分的电转染试剂

7、电转后培养液的选择

细胞在电击后十分脆弱，所以在培养液的选择中应该最注重提高细胞的存活率，一般选择低渗的RPMI 1640+10％FCS。除此之外，可参考 加入50 mmol／L海藻糖+1.25％DMSO，因为海藻糖具有稳定DNA、蛋白质以及细胞膜的作用，并提高电转后细胞特别是淋巴细胞的存活率。

（附：调亡是细胞电击后死亡的主要原因，电击后的培养液还可以加入Caspase抑制剂和SCFGM-CSF等细胞因子）