产品特点

◎基因工程优化的TdT酶，卓越的脱氧核糖核苷转移活性，可以在凋亡细胞断裂的DNA 3’-OH端催化掺入更多的FITC-12-dUTP；

◎特别配方的标记缓冲液，有效缩小FITC-12-dUTP掺入DNA链的空间位阻，使FITC标记效应达到最大化；

◎荧光信号清晰，背景干净，特别适用于细胞涂片、爬片、石蜡切片和冰冻切片等。

产品介绍

TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)是检测细胞凋亡的经典方法。本试剂盒采用TUNEL法，采用高活性的基因重组末端脱氧核糖核苷转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT），在凋亡细胞断裂的DNA 3’-羟基（3’-OH）末端催化掺入FITC-12-dUTP，通过检测FITC-12-dUTP标记的DNA片段来检测细胞凋亡。FITC-12-dUTP标记的DNA可以用荧光显微镜直接观察，也可用流式细胞仪检测。试剂盒经反复多次优化，FITC-12-dUTP标记和未标记dNTP处于最佳搭配比例，这样在进行3’-OH末端核苷酸掺入时，同一个断裂的DNA片段末端可以有更多的FITC-12-dUTP掺入，从而大大提高了检测的灵敏度，减少了背景反应。再加上我们高活性的TdT酶，使得本试剂盒的检测信噪比得以大幅提升，显著优于部分同类试剂盒。

方法步骤:

1. 样品预处理方案

A. 石蜡包埋组织切片

1) 室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中浸泡5分钟。更换新的二甲苯再浸泡5分钟以彻底脱掉石蜡；

2) 用100%乙醇浸泡5分钟，更换新的100%乙醇再浸泡5分钟；

3) 用梯度乙醇（90、80、70%）将切片各浸洗一次，每次3分钟，逐渐增加水分；

4) 用PBS轻轻润洗切片，并用滤纸吸干玻片上样本周围多余的液体。这时可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中，切勿让样品干燥。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润；

5) 用PBS稀释2mg/ml的蛋白酶K溶液，使其终浓度为20µg/ml；

6) 每个样本上滴加100µl稀释后的蛋白酶K溶液，使其被全部覆盖，室温孵育20分钟；

7) 用PBS溶液润洗样品。轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

注意：为得到最好的结果，蛋白酶K孵育时间可能需要优化。

B.组织冰冻切片

1) 将破片浸没在4%多聚甲应溶液(溶于PBS)中，室温孵育15分钟；

2) 去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体；

3) 将玻片浸没在PBS溶液中，室温孵育15分钟；

4) 去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。用石蜡笔或指甲油在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中，切勿让样品干燥。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润；

5) 用PBS稀释2mg/ml的蛋白酶K溶液，使其终浓度为 20µg/ml；

6) 每个样本上滴加100µl稀释的Proteinase K溶液，使其被全部覆盖，室温孵育10分钟；

7) 在盛有PBS溶液的敞口烧杯中浸没清洗样本2-3次；

8) 去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

C. 细胞片

1) 固定细胞，将细胞片浸入装有4%新鲜配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，在4℃放置 25分钟；

2) 洗涤载玻片，将其浸入PBS中，室温放置5分钟。重复用PBS洗一次；

3) 轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。这时可用石蜡笔或指甲油在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中，切勿让样品干燥。处理好的样本放在混盒中保榜样本的湿润；

4) 用PBS稀释2 mg/ml的蛋白酶K溶液，使其终浓度 为20µg/ml；

5) 每个样本上滴加100µl稀释的蛋白酶 K溶液，使其被全部覆盖，室温孵 育5分钟(也可浸于0.2%配制于PBS中的Triton® X -100溶液中，室温孵育5分钟进行通透处理)；

6) 在盛有PBS溶液的敞口烧杯中浸没清洗样本2-3次；

7) 轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

2. 标记及检测

1) 用去离子水将5×Equilibration Buffer稀释成1×Equilibration Buffer。

2) 滴加100ul 1×Equilibration Buffer使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育10-30分钟。同时，在冰上解冻FITC-12-dUTP Labeling Mix，并且依照表1，准备足够量的用于所有实验和阳性对照反应的TdT孵育缓冲液。对于面积小于5cm2的一个标准反应，其体积是50µl，用50µl乘以实验和阳性对照反应的数目来确定所需TdT孵育缓冲液的总体积。对于表面积更大的样本，可成比例的增大试剂体积。

3) 在平衡后的区域周围用吸水纸吸掉多余的 Equilibration Buffer，不要让组织或细胞发干， 然后在组织或细胞上加50ulTdT孵育缓冲液。

4) 把塑料盖玻片盖在细胞上以保证试剂的平均分布，在湿盒的底部放上用水浸湿的纸巾，将载玻片置于湿盒内，再将湿盒用铝箔纸包裹以避免光照, 37℃孵育60分钟。

表1.准备用于实验和阳性对照反应的TdT孵育缓冲液

5) 移除盖玻片，并将切片置于PBS溶液中室温孵育5分钟。

6) 轻轻去掉多余液体，换用新鲜的PBS溶液室温孵育5分钟。重复该步骤1次。

7) 用滤纸轻轻擦掉样本周围及背面的PBS溶液。

注意：为了降低背景，可以尝试载玻片在步骤5用PBS洗一遍之后，再用含0.1% Triton® X-1 00和5mg/ml BSA的PBS洗三次（取代步骤6），每次5分钟，这样游离的未反应的标记物可以清除较干净。

8) 将载玻片浸入装有PI溶液的染色缸，暗室室温放置5分钟，此 处PI溶液是用PBS新配稀释到1µg/ml的。

9) 洗涤样本，将载玻片浸入去离子水中，室温放置5分钟，共洗三次。

10) 将载玻片上多余的水吸干，但组织或细胞保持湿润。

11) 立即在荧光显微镜下分析样本，用标准的荧光过滤装置在520 ± 20 nm的荧光下观察绿 色荧光。在>620 nm下观察PI的红色荧光。如有必要，载玻片可在4℃ 黑暗条件下存放过夜。

3. 阳性对照制备：如有必要，可按下述制备阳性对照。

1) 在样本预处理之后，加100ul DNA酶I缓冲液到固定的细胞上，室温孵育5分钟；

2) 轻去液体，加入100µl 20U/ml DNA酶I稀释液，室温孵育10分钟；

3) 轻叩载玻片去掉多余的液体，并将载玻片在装有去离子水的染色缸中彻底洗3-4次。

注意事项：

阳性对照载波片必须使用单独的染色缸。否则来自阳性对照载玻片上残余的DNA酶I活性可能会在实验载玻片上引入高的背景。